Humanisation d’anticorps monoclonaux

Form. Humanisation d’anticorps


Chez ProteoGenix, nous savons très bien que l’humanisation d’un anticorps est l’une des étapes les plus critiques pour l’obtention d’un agent expérimental. Nos experts ont bâti leur réputation internationale sur leurs résultats exceptionnels : trois anticorps thérapeutiques sur le marché et plus de trente anticorps en phases précliniques et cliniques. Chaque nouveau projet d’humanisation d’un anticorps est pour nous un défi unique que nous relevons avec enthousiasme pour développer le meilleur produit possible pour les phases cliniques.

Pourquoi choisir ProteoGenix pour
l’humanisation de votre anticorps monoclonal ?

Des experts en humanisation d’anticorps reconnus

  Des experts ayant plus de 25 années d’expérience et des résultats inégalés dans l’humanisation d’anticorps.

Modélisation en 3D

Notre plate-forme de modélisation moléculaire en 3D garanti la conservation de la fonction biologique de votre anticorps.

Libres de droits

Vous détenez l’entière propriété de vos anticorps humanisés.

Un ensemble complet de services de caractérisation

ELISA, détermination du KD vis-à-vis de l’antigène soluble ou cellulaire, thermostabilité, taux d’agrégation, IC50…

XtenCHOTM

Bénéficiez du système d’expression transitoire le plus productif pour la production de tous les variants de votre anticorps monoclonal humanisé.

Diversité des formats

Nous optimisons la séquence ou humanisons tous les types de format d’anticorps : IgG complète, scFv, Fab, VHH (nanobodies)…

Notre processus d’humanisation d’anticorps monoclonaux

  • Séquençage de l’anticorps à partir de la lignée d’hybridome

– Extraction et purification des ARN
– Transcription inverse
– Amplification par PCR
– Séquençage

  • Évaluation de la bioactivité de l’anticorps chimérique

– Synthèse des gènes avec optimisation des codons
– Sous-clonage dans un vecteur d’expression
– Production et purification de l’anticorps chimérique
– Analyse QC

Go/No Go1

  • Conception de l’anticorps monoclonal humanisé

– Identification des rétro-mutations par modélisation moléculaire en 3D
– Sélection des lignées germinales humaines les plus appropriées
– Greffe des CDR in silico et optimisation des séquences

Go/No Go2

  • Production des anticorps humanisés (9 à 10 variants)

– Synthèse des gènes avec optimisation des codons
– Sous-clonage dans un vecteur d’expression
– Transfection transitoire, expression et purification
– Analyse QC

Go/No Go3

  • Caractérisation des variants humanisés

– ELISA contre l’antigène
– Affinité des anticorps vis-à-vis de l’antigène soluble ou cellulaire
– Taux d’agrégation
– Thermostabilité
– Profil de glycosylation
– Détection des endotoxines

Contenu de notre service d’humanisation d’anticorps monoclonaux

ÉtapeContenuDélaiLivrables
Séquençage de l’anticorps parental à partir de l’hybridome
  • Lignée d’hybridome fournie par le client ou développée par ProteoGenix
  • Extraction et purification des ARN
  • Transcription inverse
  • Amplification des ADNc
  • Analyse des séquences
~2-3 semaines
  • Rapport détaillé
  • Séquence de l’anticorps
Expression et purification de l’anticorps chimérique
  • Optimisation des codons pour système d’expression en cellules de mammifère
  • Synthèse de gènes
  • Sous-clonage dans des vecteurs d’expression
  • Expression transitoire
  • Purification
  • Analyse QC : SDS-PAGE, Western blot, UV280
~7-9 semaines
  • Rapport détaillé
  • Échantillon d’anticorps chimérique à tester
Conception de l’anticorps humanisé
  • Analyse bio-informatique
  • Modification de la structure 3D et identification des rétro-mutations
  • Sélection des lignées germinales humaines
  • Greffe des CDR in silico
  • Optimisation des séquences
~2 semaines
  • Rapport détaillé
  • Discussion avec l’un de nos experts en anticorps thérapeutiques
Production transitoire de 9 à 18 variants humanisés recombinants de l’anticorps
  • Optimisation des codons pour système d’expression en cellules de mammifère
  • Synthèse de gènes
  • Sous-clonage dans des vecteurs d’expression
  • Expression transitoire
  • Purification
  • Analyse QC : SDS-PAGE, Western blot, UV280
~7-9 semaines
  • Rapport détaillé
  • Échantillons d’anticorps humanisés purifiés à tester
Caractérisation des variants humanisés de l’anticorps monoclonal
  • Analyse de l’affinité vis-à-vis de l’antigène par ELISA
  • Analyse des agrégats d’anticorps (SEC-HPLC)
  • Détermination de l’affinité (Kd) vis-à-vis de l’antigène soluble (SPR/Biacore X100)
  • Détermination de l’affinité (Kd) vis-à-vis de l’antigène exprimé à la surface cellulaire (SPRi/Horiba XelPlex)
À déterminer
  • Rapport détaillé
  • Discussion avec l’un de nos experts en anticorps thérapeutiques
Options disponibles :

  • Analyse par DSC (analyse de la thermostabilité par analyse calorimétrique différentielle)
  • Profil de glycosylation (LC/MS)
  • Test de détection des endotoxines
  • Analyse par FACS

Quels facteurs faut-il prendre en compte pour l’humanisation des anticorps monoclonaux ?

L’objectif principal du processus d’humanisation d’un anticorps est de développer une séquence d’anticorps conforme aux directives de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) pour les anticorps humanisés. Un anticorps est considéré comme étant humanisé si sa séquence est identique à au moins 85 % de la séquence d’une lignée germinale humaine (de la base de données IMGT). La différence entre anticorps humanisé et anticorps entièrement humain dépend de l’origine de l’anticorps ; les anticorps provenant d’autres espèces que l’homme sont classifiés comme humanisés après leur humanisation alors que les séquences dérivées de l’homme sont considérées comme des « anticorps entièrement humain ».

Pour atteindre cet objectif de 85 % d’identité, il faut modifier la séquence de l’anticorps dans les régions variables. Ce travail d’ingénierie peut donc avoir un impact critique sur les propriétés physico-chimiques et pharmacologiques du produit final et doit être réalisé avec la plus grande précaution. ProteoGenix possède un savoir-faire inégalé en ingénierie des anticorps et des experts forts de 25 années d’expérience en humanisation des anticorps pour mener à bien l’humanisation de votre anticorps. Notre processus d’humanisation comprend la greffe des CDR, la modélisation moléculaire et l’optimisation de la séquence.

La modélisation moléculaire constitue une part importante de ce processus, car elle permet d’analyser les contributions de chaque acide aminé situé dans les boucles des CDR et les régions charpentes. Cette étape est essentielle pour l’identification des résidus pouvant faire l’objet d’une rétro-mutation ou d’une mutation pour optimiser les propriétés de l’anticorps. Les acides aminés impliqués dans les régions variables peuvent être classifiés comme suit :

  • Les résidus impliqués dans l’interaction anticorps-antigène,

  • Les résidus jouant un rôle structurel en maintenant la conformation des boucles des CDR ou en stabilisant l’interaction VH-VL ,

  • Les résidus interagissant avec le solvant.

Les résidus des régions charpentes de souris considérés comme critiques pour le maintien de la conformation des boucles des CDR et de la bioactivitéseront rétro-mutés dans les lignées germinales humaines sélectionnées.

La sélection des lignées germinales humaines est basée sur l’homologie de séquence, mais d’autres variants d’humanisation, avec une homologie de séquence plus faible mais présentant de bonnes propriétés physico-chimiques, peuvent être testés. Pour un projet d’humanisation, ProteoGenix sélectionne plusieurs chaînes lourdes et plusieurs chaînes légères afin de générer entre 9 et 18 combinaisons.

Les différents anticorps générés sont ensuite caractérisés et comparés à l’anticorps parental et/ou l’anticorps chimérique de référence de sorte à évaluer leurs :

  • L’immunogénicité,

  • Propriétés pharmacologiques (affinité, spécificité…),

  • propriétés pharmacologiques (affinité, spécificité…),

  • Fabricabilité.

Si les tests sont concluants, les leads peuvent être sélectionnés pour une humanisation plus poussée et/ou l’optimisation des séquences des CDR pour l’amélioration des propriétés biophysiques (hétérogénéité, fragmentation, agrégation…) et de la fabricabilité ( bioproduction).

Le processus complet de maturation d’affinité peut être réalisé par phage display à l’aide de banques à façon générées par mutagenèse aléatoire ou dirigée.