Humanisierung von monoklonalen antikörpern

Antibody humanization form

Wir sind uns bewusst, dass die Antikörperhumanisierung zu den kritischsten Schritten auf Ihrem Weg zur klinischen Prüferlaubnis zählt. Deshalb gehören unsere Experten zu den renommiertesten Wissenschaftlern auf diesem Gebiet und können eine beeindruckende Erfolgsbilanz vorweisen, unter anderem 3 zugelassene therapeutische Antikörper sowie über 30 Antikörper, die in der präklinischen oder klinischen Prüfung befinden. Für uns ist jede Humanisierung eines neuen monoklonalen Antikörpers ein Teil der einzigartigen und spannenden Herausforderung, Ihr Molekül in die klinische Phase zu bringen.

Warum ist ProteoGenix der richtige Partner für die
Humanisierung Ihres monoklonalen Antikörpers?

Anerkannte Experten für die Antikörperhumanisierung

Sichern Sie sich Zugang zu Experten mit mehr als 25 Jahren Erfahrung in der Antikörperhumanisierung..

3D-Modellierung

Unsere 3D-Molekülmodellierungsplattform garantiert den Erhalt der biologischen Funktion.

IP-frei

Die humanisierten Antikörper gehen vollständig in Ihr Eigentum über.

Umfassende Charakterisierungsservices

ELISA, KD-Bestimmung gegen lösliches Antigen oder Zellen, Thermostabilität, Aggregationsrate, IC50 …

XtenCHOTM

Profitieren Sie vom produktivsten transienten Expressionssystem, mit dem sich alle Varianten Ihres humanisierten monoklonalen Antikörpers erzeugen lassen.

Formatvielfalt

Wir führen Sequenzoptimierung oder Humanisierung aller Arten von Antikörperformaten durch: vollständiges IgG, scFv, Fab, VHH (Nanobodies) …

Unser Prozess zur Humanisierung von monoklonalen Antikörpern

  • Antikörpersequenzierung ausgehend von der Hybridomazelllinie

– RNA-Extraktion und -Aufreinigung
– Reversen Transkription
– PCR-Amplifikation
– Sequenzierung

  • Bewertung der Bioaktivität von chimärischen Antikörpern

– Gensynthese mit Codon-Optimierung
– Subklonierung in Expressionsvektor
– Herstellung und Aufreinigung von chimärischen Antikörpern
– QK-Analyse

Go/No Go1

  • Design von humanisierten monoklonalen Antikörpern

– Identifikation von Rückmutationen mittels 3D-Molekülmodellierung
– Selektion der humanen Keimbahnen mit der höchsten Relevanz
– In-silico-CDR-Grafting und Sequenzoptimierung

Go/No Go2

  • Herstellung der humanisierten Antikörper (9–18 Varianten)

– Gensynthese mit Codon-Optimierung
– Subklonierung in Expressionsvektor
– Transiente Transfektion, Expression und Aufreinigung
– QK-Analyse

Go/No Go3

  • Charakterisierung der humanisierten Varianten

– ELISA gegen Antigen
– Antikörperaffinität gegen lösliches Antigen oder Zelle
– Aggregationsrate
– Thermostabilität
– Glykosylierungsprofil
– Endotoxinbestimmung

Leistungsumfang unserer Services für die Humanisierung von monoklonalen Antikörpern

Schritt Leistungen Zeitrahmen Lieferumfang
Elternantikörper-Sequenzierung aus Hybridoma
  • Vom Kunden bereitgestellte oder von ProteoGenix entwickelte Hybridomazelllinie
  • RNA-Extraktion und -Aufreinigung
  • Reverse Transkription
  • cDNA-Amplifikation
  • Sequenzierungsanalyse
ca. 2–3 Wochen
  • Ausführlicher Bericht
  • Antikörpersequenz
Herstellung und Aufreinigung von chimärischen Antikörpern
  • Codon-Optimierung für Säuger-Expressionssystem
  • Gensynthese
  • Subklonierung in Expressionsvektoren
  • Transiente Expression
  • Aufreinigung
  • QK-Analyse: SDS-PAGE, WB, UV280
ca. 7–9 Wochen
  • Ausführlicher Bericht
  • Probe chimärischer Antikörper zum Testen
Design des humanisierten Antikörpers
  • Bioinformatik-Analyse
  • 3D-Strukturmodellierung und Identifikation von Rückmutationen
  • Selektion humaner Keimbahnen
  • In-silico-CDR-Grafting
  • Sequenzoptimierung
ca. 2 Wochen
  • Ausführlicher Bericht
  • Besprechung mit eines unserer Experten für therapeutische Antikörper
Transiente rekombinante Produktion von 9 bis 18 humanisierten Antikörpervarianten
  • Codon-Optimierung für Säuger-Expressionssystem
  • Gensynthese
  • Subklonierung in Expressionsvektoren
  • Transiente Expression
  • Aufreinigung
  • QK-Analyse: SDS-PAGE, WB, UV280
ca. 7–9 Wochen
  • Ausführlicher Bericht
  • Aufgereinigte humanisierte Antikörperproben zum Testen
Charakterisierung der humanisierten monoklonalen Antikörpervarianten
  • Affinitätsanalyse mittels ELISA gegen das Antigen
  • Analyse der Antikörperaggregate (SEC-HPLC)
  • Affinitätsbestimmung (Kd) gegen lösliches Antigen (SPR/Biacore X100)
  • Affinitätsbestimmung (Kd) gegen auf Zelloberfläche exprimiertes Antigen (SPRi/ Horiba XelPlex)
Noch festzulegen
  • Ausführlicher Bericht
  • Besprechung mit eines unserer Experten für therapeutische Antikörper

Verfügbare Optionen:

  • DSC-Analyse (Thermostabilitätsanalyse mittels dynamischer Differenzkalorimetrie)
  • Glykosylierungsprofil (LC/MS)
  • Endotoxinbestimmung
  • FACS-Analyse

Welche Faktoren sind bei der Humanisierung monoklonaler Antikörper zu beachten?

Die Humanisierung von Antikörpern dient in erster Linie dazu, eine Antikörpersequenz zu erhalten, die den Leitlinien der Weltgesundheitsorganisation (WHO) für humanisierte Antikörper entspricht. Grundsätzlich gilt ein Antikörper als humanisiert, wenn die Sequenzübereinstimmung zwischen dem Antikörper und einer humanen Keimbahn (aus der IMGT-Datenbank) mindestens 85 % beträgt. Der Unterschied zwischen humanisiert und vollhuman hängt von der Herkunft des Antikörpers ab: Antikörper aus nichthumanen Spezies werden nach der Humanisierung als „humanisiert“ eingestuft, während Sequenzen menschlichen Ursprungs als „vollhuman“ gelten.

Zum Erreichen des 85-%-Ziels ist eine Modifikation der Antikörpersequenz in den variablen Regionen nötig. Somit kann das Antikörper-Engineering einen entscheidenden Einfluss auf die physikalisch-chemischen und pharmakologischen Eigenschaften des Endprodukts haben und sollte sorgfältig durchgeführt werden. ProteoGenix kombiniert deshalb sein unübertroffenes Know-how im Bereich Antikörper-Engineering mit Experten, die über mehr als 25 Jahre Erfahrung verfügen und eine beachtliche Erfolgsbilanz in der Antikörperhumanisierung vorweisen können. Unser Humanisierungsprozess umfasst CDR-Grafting, Molekülmodellierung und Sequenzoptimierung.

Die Molekülmodellierung ist ein wichtiger Prozessbestandteil, da sie es ermöglicht, den Anteil der einzelnen Aminosäuren in den murinen CDR-Schleifen und in Framework-Regionen zu analysieren. Dieser Schritt ist unerlässlich, um für Rückmutationen geeignete Reste sowie solche, die zur weiteren Optimierung der Eigenschaften mutiert werden können, zu bestimmen. Die Aminosäuren der variablen Regionen können wie folgt eingeteilt werden:

  • Reste, die an der Antikörper-Antigen-Wechselwirkung beteiligt sind

  • Reste mit struktureller Funktion, beispielsweise Aufrechterhaltung der CDR-Schleifenkonformation oder Stabilisierung der VH-VL -Wechselwirkung

  • Reste, die mit dem Lösungsmittel interagieren

Reste aus den murinen Framework-Regionen, die als kritisch für die Aufrechterhaltung der CDR-Schleifenkonformation und der Antikörper-Bioaktivität eingestuft werden, werden in die selektierten humanen Keimbahnen rückmutiert.

Die Selektion der humanen Keimbahnen basiert auf der Sequenzhomologie, es können jedoch auch andere Humanisierungsvarianten getestet werden, die eine geringere Sequenzhomologie, aber gute physikalisch-chemische Eigenschaften aufweisen. In einem Humanisierungsprojekt selektiert ProteoGenix verschiedene schwere und leichte Ketten, um 9 bis 18 Kombinationen zu generieren.

Die verschiedenen generierten Antikörper werden genauer charakterisiert und mit dem Eltern- und/oder chimärischen Referenzantikörper verglichen, um folgende Eigenschaften zu beurteilen:

  • Immunogenität

  • physikalisch-chemische Eigenschaften (Stabilität, Aggregationsrate, …)

  • pharmakologische Eigenschaften (Affinität, Spezifität, …)

  • Herstellbarkeit

Nach erfolgreichen Tests können Antikörperkandidaten für die weitere Humanisierung und/oder CDR-Sequenzoptimierung zwecks Verbesserung der biophysikalischen Eigenschaften (Heterogenität, Fragmentierung, Aggregation, …) und der Herstellbarkeit (Bioproduktion) selektiert werden.

Umfassende Services für die Antikörper-Affinitätsreifung können mittels Phagen-Display unter Verwendung kundenspezifischer, per zufälliger oder Target-Mutagenese erzeugter Bibliotheken realisiert werden.