SINTESI PEPTIDI CUSTOM

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Linee guida utili per lavorare
con peptidi sintetici

Come testare la solubilità del tuo peptide sintetico custom

Il metodo più usato per testare la solubilità si basa sulla determinazione della carica. Per i peptidi piccoli (fino a 5 amminoacidi), l’acqua distillata è la prima opzione. Negli altri casi, segui questa guida:

1. Attribuisci -1 a ogni residuo acido (Asp / D, Glu / E) e al gruppo carbossilico terminale. Assegna +1 a ogni residuo basico (Arg / R, Lys / K, His/h) e all’amine terminale. Somma i valori per ottenere la carica totale del peptide
2. Se la carica totale è positiva, prova a dissolvere il peptide in acqua. Se non si dissolve, acidifica la soluzione con acido acetico (10–30%). Se non basta, aggiungi TFA per migliorare la solubilità.
3. Se la carica totale è negativa e il peptide non contiene cisteina, prova con acqua. Se non si dissolve, aggiungi idrossido di ammonio fino a concentrazione desiderata.
4. Se la carica calcolata è zero, il peptide può essere diluito con solventi organici (metanolo, etanolo, isopropanolo o acetonitrile). Una piccola quantità di DMSO diluito in acqua può essere usata a seconda dell’applicazione finale. Attenzione con peptidi contenenti cisteina, metionina o triptofano, più sensibili all’ossidazione: in questi casi, usare DMF al posto del DMSO.

Come progettare peptidi antigenici per vaccini e produzione di anticorpi

I peptidi antigenici sintetici sono strumenti potenti per la generazione di anticorpi policlonali o monoclonali e come componenti di vaccini peptidici. Per queste applicazioni, i peptidi devono essere progettati secondo due criteri: antigenicità e immunogenicità. L’antigenicità indica la capacità dell’antigene di interagire col sito funzionale dell’anticorpo, mentre l’immunogenicità riflette la capacità del peptide di stimolare una risposta umorale e/o cellulare. Per produrre vaccini ed anticorpi efficaci, i peptidi devono avere entrambe le proprietà.

Puoi aumentare l’antigenicità così:

1. Scegliendo sequenze idrofiliche: le regioni solubili hanno residui idrofili esposti, più idonei a stimolare la risposta immune.
2. Garantendo alta accessibilità dell’epitopo: l’ingombro sterico può ostacolare l’interazione anticorpo-antigene anche nelle regioni idrofile, è fondamentale assicurarsi che l’epitopo sia accessibile nella proteina nativa.
3. Optando per una lunghezza ottimale: per massima antigenicità, i peptidi dovrebbero essere tra 10 e 20 AA. Peptidi più corti (<10 AA) difficilmente sono riconosciuti; peptidi più lunghi (>20 AA) rischiano di assumere conformazioni tridimensionali che non riflettono la struttura della proteina nativa.

Per massimizzare l’immunogenicità, puoi accoppiare i peptidi a carrier seguendo queste indicazioni:

1. Orientamento del peptide: il peptide deve essere presentato in modo simile a come sarebbe nella proteina nativa.
2. Natura della proteina carrier: la proteina carrier contiene diversi epitopi immunogenici, dunque la scelta è fondamentale. KLH e BSA sono le più usate, ma KLH è preferibile per massa e complessità, generando una risposta superiore.

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La sintesi peptidica in fase solida ha dominato il mercato della produzione custom per decenni. Sviluppata negli anni ’50, è diventata una tecnologia ancora oggi insuperata in termini di automazione, convenienza, scalabilità, tempi rapidi e rese elevate.

Il processo si svolge tradizionalmente su un supporto solido, in modo sequenziale, dal C-terminale verso l’N-terminale. Si utilizzano amminoacidi protetti in Nα per controllare la direzione della sintesi e minimizzare le reazioni secondarie. Attualmente si impiegano principalmente i gruppi protettivi Boc (t-butyloxycarbonil) e Fmoc (9-fluorenilmetossicarbonil).

Oltre a questi, vengono spesso utilizzati gruppi protettivi permanenti sulle catene laterali, che prevengono ramificazioni indesiderate e resistono a vari cicli chimici durante la sintesi. Vengono rimossi solo nella fase finale tramite acidi forti. Benzil (Bzl) e tert-butil (tBu) sono i principali protettori di catena laterale.

La sintesi stepwise avviene così:

1. Deprotezione: I gruppi protettivi Nα vanno rimossi per consentire l’aggiunta di un nuovo residuo all’N-terminale. Si usano agenti specifici: TFA (acido trifluoroacetico) per Boc, piperidina per Fmoc.
2. Accoppiamento: Per aggiungere un nuovo amminoacido, serve attivare il gruppo carbossilico C-terminale. I carbodiimmidi come DCC o DIC sono i reagenti principali.
3. Clivaggio: Terminati i cicli di deprotezione e accoppiamento, tutti i protettori residui vanno rimossi dal polipeptide. Si usano acidi forti: acido fluoridrico (HF), bromidrico (HBr) o acido trifluorometansulfonico (TFMSA) per Boc e Bzl, mentre TFA basta per Fmoc e tBut. In questa fase la catena viene anche separata dal supporto solido e ulteriormente purificata.

L’uso di reagenti forti può ostacolare la purificazione. In questi casi, si sceglie la sintesi in fase liquida per la produzione di peptidi GMP. Anche se più lenta (e con rese inferiori), la sintesi liquida si usa per piccoli peptidi altamente puri (<10 AA).

Entrambi sono metodi chimici per produrre peptidi lineari. Quando servono peptidi grandi o più complessi, meglio l’espressione ricombinante, sebbene limitata agli amminoacidi naturali.

Quindi, per peptidi con strutture complesse o amminoacidi non convenzionali, la strategia semisintetica è la soluzione ideale.

Metodi di purificazione dei peptidi più efficienti

Sebbene la maggior parte dei metodi di sintesi sia molto efficiente, possono comunque generarsi impurità indesiderate a causa di deprotezione incompleta, reazioni indesiderate, troncamento e/o delezione di residui, isomeri e altri sottoprodotti.

La rimozione di tali impurità si ottiene con varie tecniche:

• Cromatografia di esclusione dimensionale
• Cromatografia a scambio ionico (IEC)
• Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)
• Cromatografia in fase inversa HPLC (RP-HPLC)
• Gel-filtration HPLC

Tra tutte, la RP-HPLC è il metodo di purificazione più diffuso. Diversamente dalla HPLC convenzionale, che separa secondo il grado di polarità nella fase mobile, la RP-HPLC cattura le molecole idrofobiche e le rilascia in base alla loro idrofobicità, facilitando la separazione tra peptidi sintetizzati correttamente e impurità.