MARCATURE ANTICORPALI

Tag comunemente usati nella marcatura degli anticorpi

Biotina-Avidina

L’avidina è una molecola che forma una delle interazioni non covalenti più forti con il suo ligando, la biotina. La formazione del legame biotina-avidina è molto rapida e altamente stabile, indipendentemente dalle condizioni (pH, temperatura e altre condizioni denaturanti). La piccola dimensione della biotina è un grande vantaggio per la marcatura degli anticorpi poiché non altera le proprietà dell’anticorpo marcato. Questa caratteristica permette inoltre alla biotina di aumentare la sensibilità di un saggio (poiché una molecola di avidina può legare fino a 3 biotine marcate).

Gli anticorpi marcati con biotina sono utilizzati in numerose tecniche come ELISA, Western blot, Immunoistochimica, FACS…
Esistono diversi metodi per marcare gli anticorpi con biotina, ma la biotinilazione su amine primarie resta la tecnica più comune. In breve, questa reazione chimica comporta la marcatura dell’anticorpo sui gruppi ε-amminici delle lisine chimicamente accessibili tramite l’uso di un estere N-idrossiscuccinimmide (NHS) di un analogo della biotina.

Perossidasi di Rafano (HRP)

La HRP (Horseradish Peroxidase) è un enzima reporter comunemente utilizzato per la marcatura degli anticorpi in diverse applicazioni come Western Blot, ELISA o IHC. Questo enzima è caratterizzato da un alto turnover, che consente di generare un segnale intenso in tempi brevi.

Tre metodi di rilevazione utilizzano frequentemente le HRP-coniugate:

• Rilevazione colorimetrica: in presenza di perossido di idrogeno, la HRP catalizza la riduzione di H2O2 in acqua ossidando un substrato come il 4-cloro-1-naftolo (4-CN), il 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) o polimerizzando il 3′-diaminobenzidina (DAB). Queste reazioni inducono la formazione di un precipitato colorato facilmente rilevabile.
• Rilevazione chemioluminescente: anche in questo caso, in presenza di perossido di idrogeno, la HRP ossida la luminolo in uno stato intermedio eccitato instabile portando alla formazione del 3′-aminoftalato e all’emissione di luce a 425 nm.
• La rilevazione fluorescente è possibile a seconda del substrato utilizzato.

Come la biotina, anche la HRP può essere coniugata ai gruppi e-amminici delle lisine chimicamente accessibili. È inoltre possibile legare la HRP ai residui di cisteina tramite una reazione in due fasi che comporta prima la riduzione dei ponti disolfuro dell’anticorpo e successivamente l’addizione elettrofila di un composto tiol-reattivo (es. un maleimide marcato).

Isotiocianato di Fluoresceina (FITC)

Il FITC è un derivato isotiocianato della fluoresceina che lo rende reattivo verso le ammine primarie e i gruppi tiolici presenti, rispettivamente, nei residui di lisina e cisteina (quando ridotti) delle biomolecole. Solitamente, per ciascun anticorpo vengono coniugate da 3 a 6 molecole di fluoresceina per evitare eventuali problemi di quenching e solubilità.
I coloranti fluorescenti come la fluoresceina sono comunemente impiegati in diverse applicazioni di laboratorio come Western Blot, citometria a flusso e immunofluorescenza.