Vous devez détecter de petites quantités de votre cible ? Laissez nous développer votre test ELISA Sandwich ! Nous garantissons que votre ELISA sandwich détectera votre cible même dans des échantillons complexes (sérums, homogénats de tissus, lysats cellulaires) car nous maîtrisons toutes les étapes du développement, de la conception de l’antigène à la production du kit pilote (validé avec vos propres échantillons).
Pourquoi choisir ProteoGenix pour votre
développement de test ELISA ?
Test ELISA Sandwich
Garanti
Nous garantissons que vous obtiendrez un Sandwich ELISA entièrement fonctionnel.
Votre ELISA Sandwich
testé en conditions réelles
Fournissez-nous vos échantillons (sérums, homogénats de tissus, lysats de cellules). Nous optimisons votre test ELISA sandwich en conditions réelles !
Obtenez votre kit pilote
prêt à l'emploi
Nos solutions entièrement intégrées comprennent le développement complet de votre ELISA sandwich, de la conception de l’antigène à la production du kit pilote.
ELISA Sandwich
Conception par des experts
Vous avez accès à notre expertise unique et à nos capacités techniques en matière de conception d’ELISA sandwich pour diverses applications.
Anticorps monoclonaux et
polyclonaux
Nous générons des anticorps polyclonaux ou monoclonaux en fonction de vos besoins.
Hybridome ou
phage display
Notre service ELISA sandwich est entièrement personnalisé. Elle peut inclure la génération d’anticorps monoclonaux par hybridome ou par phage display.
Notre processus de développement du test ELISA en sandwich
Services: Details du processus
Ayant aidé un grand nombre d’entreprises, de laboratoires et de chercheurs individuels avec nos services de développement de tests ELISA, nous avons réussi à établir et à affiner une procédure de développement de tests personnalisés qui prend en compte tous les aspects de votre recherche afin de fournir des solutions de tests adaptées pour la recherche, le CE ou les objectifs IVD. Voici le plan de nos services d’analyses personnalisées :
Étude des spécifications de l'essai
Dans un premier temps, nous étudions votre besoin afin de vous proposer les solutions les plus pertinentes.
Conception d'une stratégie d'essai personnalisée
Une fois que nous avons déterminé que les kits ELISA, les sandwichs ELISA ou les paires d’anticorps existants ne sont pas suffisants pour répondre à vos exigences (spécificité, sensibilité, réactivité croisée, etc.), nous concevons une stratégie entièrement personnalisée pour le développement du test, en consultation avec vous. C’est une étape très importante qui détermine le succès du projet. Il existe de nombreuses stratégies possibles pour développer un test qui réponde à des exigences spécifiques et chaque étape du processus est critique.
Synthèse de gènes
Notre stratégie de développement de tests personnalisés commence à se concrétiser avec la synthèse d’ADNc double brin. Grâce aux contrôles de qualité renforcés qui guident notre système, nous garantissons un séquençage précis à 100 %, avec une efficacité globale supérieure à 99,9 %. Nous perfectionnons encore notre protocole de synthèse de gènes en effectuant une série de mutagenèses génétiques pour éliminer toute trace d’erreur. Au fil des ans, nous nous sommes forgé une formidable réputation en étant parmi les meilleurs prestataires de services lorsqu’il s’agit de produire avec succès des réactifs personnalisés, en commençant par une optimisation et une synthèse précises des gènes. L’optimisation des gènes et la conception de la construction sont très importantes pour produire à l’étape suivante l’antigène le plus approprié.
Production de Protéine/Peptide
La production précise de chaînes de protéines ou de peptides recombinants avec un facteur de rendement suffisant pour soutenir le développement ultérieur d’anticorps est une étape vitale, en ce qui concerne le développement de tests personnalisés. Forts d’une grande expertise à cet égard, nous veillons à ce que nos processus de développement de tests ELISA compétitifs personnalisés, de tests ELISA sandwich personnalisés ou d’autres formats de tests reposent sur une base solide d’anticorps développés avec une production efficace d’antigènes de grande pureté.
La production de protéines/peptides, en fonction des exigences de votre projet et de vos objectifs de recherche, peut également être exprimée pour la livraison d’échantillons dans les systèmes les mieux adaptés, notamment E.coli, B.subtilis, la levure, les cellules d’insectes (baculovirus) et les cellules de mammifères, afin de diversifier les procédures en aval dans le développement des essais. Si nécessaire, notre équipe de scientifiques exprimera également la protéine ou le peptide recombinant dans tous ces systèmes en parallèle, afin de trouver les meilleures conditions d’expression et d’améliorer la validité du résultat final des anticorps utilisés dans le test personnalisé que vous avez commandé.
Développement d'anticorps primaires
Nous prenons grand soin de développer des anticorps primaires à partir de l’échantillon d’antigène généré à l’étape précédente. Comme vous devez le savoir, il s’agit peut-être du processus le plus délicat du projet de développement d’un essai personnalisé, et c’est pourquoi nous avons développé au fil des ans une expertise inégalée en matière d’anticorps monoclonaux et polyclonaux. Outre les techniques et les équipements de pointe disponibles dans nos laboratoires, il convient également de noter que toutes nos animaleries respectent les normes éthiques les plus strictes.
Génération d’anticorps monoclonaux
- Développement d’hybridomes avec immunisation génétique ou immunisation simple par antigène protéique
- Technique de Phage display avancée avec le criblage de banque naïve ou immune
- Haut niveau de garantie
- Possibilité de livraison autonome d’anticorps monoclonaux si nécessaire.
Génération d’anticorps polyclonaux
- Systèmes animaux multiples pour la génération précise d’anticorps polyclonaux par immunisation génétique ou immunisation simple par antigène protéique
- Haut niveau de garantie
- Possibilité de livraison autonome d’anticorps polyclonaux si nécessaire.
Services analytiques
Après la production réussie des anticorps primaires souhaités, nous mettons en place nos services d’analyse. Avant la conjugaison, nous proposons trois techniques avancées, sans marquage, de mesure de l’affinité des anticorps pour évaluer les niveaux d’interactions biomoléculaires.
- Résonance plasmonique de surface (SPR by Biacore™)
- Imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi by HORIBA Scientific®)
- Détection rapide étendue (Octet®RED de PALL Fortébio)
Conjugaison d'anticorps pour le test ELISA en sandwich
L’étape suivante de nos services de développement de tests personnalisés est la conjugaison des anticorps. Grâce à la pureté des anticorps produits au cours de l’étape précédente, nous pouvons garantir que le résultat final de la conjugaison des anticorps ne contiendra pas de chaînes protéiques ou de groupes aminés parasites pouvant avoir une incidence sur le processus de conjugaison. Grâce à l’utilisation des dernières techniques de pointe et à un choix de méthodes de marquage multiples, nous ne négligeons aucun détail pour mener à bien cette étape essentielle au développement d’un dosage précis.
- Conjugaison rapide
- Processus en une seule étape pour améliorer la précision
- Conjugaison de minimum 10 anticorps
Appariement de paires d'anticorps pour le test ELISA sandwich
En travaillant en symétrie avec les processus de développement des anticorps primaires (voir l’étape 5), nous déterminons et développons les paires d’anticorps les mieux adaptées (anticorps de revêtement et anticorps de détection) pour le test ELISA sandwich personnalisé. Nous effectuons au moins 90 tests d’appariement pour nous assurer que la paire d’anticorps la plus appropriée est sélectionnée. La précision d’un kit Sandwich ELISA sera entièrement dépendante de la réussite de l’appariement, et il est donc important de s’adresser à un fournisseur expérimenté dans le développement de tests personnalisés, comme ProteoGenix, qui maîtrise l’ensemble du processus, de la synthèse des gènes aux productions pilotes de kits.
- Correspondance précise des paires d’anticorps
- Gain de temps
- Techniques avancées de mise en correspondance pour les paires uniques
- Tests de correspondance étendus (plus de 90)
Optimisation et développement des protocoles ELISA
En fonction du caractère unique de l’antigène cible et de la sensibilité souhaitée de l’anticorps, nous développons un protocole ELISA entièrement optimisé (Sandwich ELISA, Competitive ELISA ou autre format). Le développement d’un protocole Sandwich ELISA ou Competitive ELISA permet de mener à bien le projet de développement de tests personnalisés. Le but de cette étape est généralement d’optimiser le signal, la sensibilité et la reproductibilité tout en réduisant au minimum le bruit de fond.
Le protocole de dosage personnalisé Sandwich ELISA ou Competitive ELISA ainsi développé est ensuite soumis à de multiples ajustements de processus afin d’optimiser le suivi contre l’antigène :
- La concentration de la paire d’anticorps
- La concentration du diluant
- La concentration du conjugué enzymatique
- La concentration du tampon
- L’intensité/la précision du signal
- La méthode bloquante
Validation du test
Vers la fin du processus de développement du test ELISA personnalisé, le test personnalisé développé est validé sur les échantillons biologiques assignés afin de s’assurer que la détection de la ou des protéines endogènes en question est réussie. La validation du test fournit également une véritable assurance que la détection de la cible est cohérente avec la protéine/peptide recombinante développée.
Production pilote du kit ELISA
Une fois que le test personnalisé est entièrement développé et validé, nous demandons l’approbation de nos clients pour passer à la production pilote de kits. Conformément à notre approche approfondie de toutes les procédures que comporte le développement d’un test personnalisé, nous fournissons tous les réactifs nécessaires dans des états entièrement développés et optimisés pour faciliter l’utilisation du test personnalisé dans votre laboratoire. Nous livrons éventuellement des dizaines ou des centaines de kits prêts à l’emploi comprenant des plaques pré-couvertes et tous les réactifs nécessaires à la réalisation des tests.
Étude de cas : développement d'un ELISA sandwich pour la détection et la quantification d'un biomarqueur du cancer de la prostate à un stade précoce
La meilleure façon de démontrer notre expertise dans le développement de sandwichs ELISA est de partager une étude de cas représentative d’un dosage de biomarqueur que nous avons développé.
Le but de ce projet était de développer et d’optimiser un test de biomarqueur pour détecter des niveaux élevés d’un biomarqueur spécifique au(x) stade(s) précoce(s) du cancer de la prostate précédemment identifié(s). L’ensemble des échantillons de donneurs de sérum pour la validation se composait d’individus sains, d’individus atteints de cancer du sein et d’individus cibles, c’est-à-dire d’individus atteints de cancer de la prostate.
DÉCOUVERTE DE BIOMARQUEURS
Un protocole standard de criblage SST a été déployé pour identifier les régulateurs d’une cible protéique commune des médicaments anticancéreux. La figure suivante (FIGURE 1) illustre le principe de fonctionnement générique du dépistage SST.
Principe du système SST
Identification in vivo de la protéine de liaison à l’ADN grâce à la fusion avec GAL4-AD et l’activation d’un gène rapporteur
DÉVELOPPEMENT D' UN PROTOCOLE ELISA SANDWICH POUR LE BIOMARQUEUR CIBLE
Les étapes détaillées ci-dessous ont été suivies pour développer un protocole Sandwich ELISA pour le biomarqueur découvert via le dépistage de la SST dans la phase préliminaire du projet de développement d’un test personnalisé.
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La production de chaînes de protéines recombinantes a été réalisée dans des volumes suffisants et à une pureté supérieure au seuil.
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10 anticorps monoclonaux de haute affinité ont été développés dans un système d’hybridomes.
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Les 10 anticorps monoclonaux ainsi développés ont été produits, purifiés et conjugués.
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Un exercice approfondi d’appariement des paires d’anticorps a été adopté, avec pas moins de 90 paires testées pour trouver la correspondance la plus appropriée.
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Le protocole Sandwich ELISA le plus optimal a été développé pour atteindre un seuil de sensibilité suffisant pour détecter la cible dans le sérum du patient.
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La paire présentant les meilleurs résultats de correspondance a été évaluée sur des échantillons biologiques marqués provenant d’un ensemble suffisamment large de donneurs (donneurs sains et patients cancéreux).
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La cartographie des épitopes a été suivie par le développement d’une banque de cellules à deux niveaux comprenant une banque de cellules maîtresse (MCB) et une banque de cellules de travail (WCB).
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DONNÉES DU PROCESSUS : DÉTERMINATION DE LA MEILLEURE PAIRE POUR L'ELISA SANDWICH
Comme décrit à l’étape 4 ci-dessus, une expérience d’appariement d’anticorps a donné lieu à un ensemble de points de données très fiables qui ont été mis en tableau et analysés graphiquement et empiriquement pour déterminer l’appariement le plus approprié.
Le graphique suivant (GRAPHIQUE 1) détaille les résultats des expériences d’appariement dérivées de l’appariement de diverses paires d’anticorps.
GRAPHIQUE 1 : Détermination de la meilleure paire pour ELISA Sandwich
Comme on peut le constater, l’anticorps de détection 4B et l’anticorps de détection 5B s’associent remarquablement bien avec l’anticorps de revêtement 17. Parmi ces deux prétendants, la paire anticorps de détection 5B et anticorps de revêtement 17 s’est avérée fournir une meilleure combinaison. Ainsi, l’analyse empirique et expérimentale de plus de 90 paires nous a permis de trouver la meilleure combinaison de paires.
DONNÉES DE PROCESSUS : OPTIMISATION DE L'ELISA EN SANDWICH
Une fois la meilleure paire d’anticorps déterminée, en utilisant une approche ELISA sandwich, un protocole de détection spécifiquement optimisé a été créé. Cela implique le choix et l’utilisation de tampons de blocage appropriés, ainsi que des périodes d’incubation, des dilutions d’anticorps et d’autres paramètres adaptés.
Le graphique suivant (GRAPHIQUE 2) trace les valeurs de concentration en fonction de la DO associée, ce qui nous donne une courbe empirique très fiable et précise qui peut être utilisée à l’avenir pour les besoins d’extrapolation dans le cadre du protocole Sandwich ELISA complet pour le dosage de ce biomarqueur.
GRAPHIQUE 2 : Détermination du seuil de détection dans les échantillons de sang
Conclusion : ce protocole Sandwich ELISA optimisé permet de détecter le biomarqueur à une concentration ≤0,2 ng/ml dans les échantillons de sang des patients.
DONNÉES SUR LE PROCESSUS : ÉVALUATION ELISA SANDWICH PERSONNALISÉE SUR DES ÉCHANTILLONS BIOLOGIQUES
L’évaluation du protocole ELISA Sandwich personnalisé a été réalisée à l’aide d’échantillons de sang provenant de donneurs sains, de patients atteints de cancer du sein et de patients atteints de cancer de la prostate. Le protocole ELISA optimisé a été utilisé pour doser les niveaux de biomarqueurs dans les échantillons par rapport aux niveaux de PSA.
Le graphique suivant (GRAPHIQUE 3) illustre les niveaux élevés de biomarqueur spécifique de la prostate chez les patients atteints de cancer de la prostate, tels que détectés par le protocole Sandwich ELISA personnalisé développé par ProteoGenix, permettant la discrimination catégorielle entre les patients non atteints de cancer de la prostate (donneurs sains et patients atteints de cancer du sein) et les patients atteints de cancer de la prostate. Cette discrimination était beaucoup plus claire et plus concluante que lors du dosage du biomarqueur PSA.
GRAPHIQUE 3 : Détermination du niveau d’antigène spécifique de la prostate dans des échantillons de sang de patients sains et de patients cancéreux (Sandwich ELISA)
Une augmentation considérable du niveau du biomarqueur spécifique de la prostate est détectée chez les patients atteints du cancer de la prostate.
CONCLUSION
Cette étude de cas représente bien plus que de simples faits, chiffres et données. Une telle avancée et la possibilité de personnaliser à ce point le processus de développement des essais – qui est par ailleurs une tâche longue, fastidieuse et méticuleuse – est un atout considérable à la disposition des chercheurs. La mise au point de tests personnalisés permet non seulement de fournir des solutions adaptées à vos projets, mais aussi d’économiser un temps précieux, de l’énergie et d’autres ressources que vous auriez autrement consacrés à essayer de faire fonctionner des tests standardisés.
FAQ sur l'ELISA sandwich
Quand dois-je faire un ELISA sandwich ? Quels sont les avantages de l'utilisation d'un ELISA sandwich ?
Le test ELISA sandwich diffère des techniques ELISA classiques par l’adsorption d’un anticorps de capture directement sur la plaque. Cela confère au test ELISA sandwich la capacité de détecter ou de mesurer la concentration d’un analyte dans un échantillon impur (contrairement aux autres techniques ELISA où l’enrobage de l’antigène se fait par adsorption non spécifique).
Quel type de méthode de détection dois-je utiliser pour mon test ELISA sandwich ?
Le test ELISA sandwich permet une détection directe ou indirecte.
La détection directe implique l’utilisation de deux anticorps primaires, un non marqué comme réactif de capture et un second anticorps primaire marqué qui sera utilisé à la fois pour la capture et la détection.
La détection indirecte implique l’utilisation de deux anticorps primaires non marqués, chacun reconnaissant un épitope différent et non chevauchant du même antigène, et d’un anticorps secondaire détectant le second anticorps primaire (celui qui n’est pas déposé sur la plaque). La détection indirecte présente de nombreux avantages par rapport à la détection directe :
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Il n’est pas nécessaire de marquer un anticorps primaire. Par conséquent, l’anticorps primaire conserve son immunoréactivité maximale.
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Les anticorps secondaires peuvent se lier à plusieurs épitopes d’un anticorps primaire, ce qui entraîne une amplification du signal.
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Une grande variété d’anticorps secondaires est disponible dans le commerce.
Quelle clonalité d'anticorps dois-je choisir comme réactif de capture pour mon test ELISA sandwich ?
Les anticorps polyclonaux et monoclonaux présentent des propriétés différentes. Alors que les anticorps monoclonaux se caractérisent par une grande spécificité due à la reconnaissance d’un seul épitope d’un antigène, les anticorps polyclonaux sont capables de reconnaître plusieurs épitopes d’un même antigène, ce qui entraîne une réactivité croisée plus élevée. Bien sûr, cela affectera les propriétés de votre ELISA sandwich.
Le choix de la clonalité appropriée dépend de votre objectif :
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Si votre objectif est de détecter une quantité maximale de votre cible, les anticorps polyclonaux comme anticorps de capture représentent la bonne solution. En revanche, l’utilisation d’anticorps polyclonaux comme réactif de capture entraînera une certaine liaison non spécifique. Ainsi, l’utilisation d’anticorps polyclonaux comme réactif de capture restera la meilleure solution si vous essayez de détecter une cible à faible concentration dans un échantillon simple.
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Si votre objectif est de détecter une cible spécifique dans un échantillon complexe, un anticorps monoclonal comme réactif de capture sera la meilleure solution.
Quels tampons dois-je utiliser pour mon test ELISA sandwich ?
Il existe de nombreux facteurs à prendre en compte pour déterminer les conditions expérimentales optimales de votre test ELISA sandwich. En ce qui concerne les tampons, il s’agit de choisir la bonne température, le bon pH, la bonne force ionique, le bon détergent… ProteoGenix inclut la définition des meilleures conditions expérimentales dans son offre de développement de Sandwich ELISA.
Suis-je sûr que mon Sandwich ELISA fonctionnera dans des conditions réelles ?
Fondamentalement, notre service de développement de tests ELISA en sandwich comprend plusieurs phases :
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Design d’antigène
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Génération d’anticorps (monoclonaux et/ou polyclonaux)
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Identification des meilleures paires d’anticorps (anticorps de capture et de détection)
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Validation des paires d’anticorps en conditions réelles (avec les échantillons du client)
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Optimisation de votre ELISA sandwich en conditions réelles
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Validation finale du test ELISA sandwich : évaluation de la sensibilité, de l’exactitude, de la reproductibilité, de la fiabilité et de la robustesse (comprend plusieurs paramètres tels que la limite de détection, la linéarité, la précision intra-plaque et inter-plaque…)
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Test de stabilité de la durée de conservation par ELISA sandwich
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Production pilote du kit ELISA sandwich
Notre service de développement ELISA sandwich comprend une étape de validation et d’optimisation avec vos propres échantillons. Cela signifie que le kit ELISA sandwich que nous livrons est entièrement fonctionnel pour vos analyses.
Principe de développement de l'ELISA sandwich
Le test ELISA sandwich est généralement une méthode permettant de doser une protéine (en bleu sur l’image ci-dessous) dans différents types d’échantillons (tels que des échantillons de sérum, des homogénats de tissus, des lysats cellulaires) en utilisant une paire d’anticorps. L’anticorps de capture (en vert ci-dessous) est adsorbé sur le plastique des plaques de 96 puits, tandis que l’anticorps de détection (en rouge dans le tableau ci-dessous) permet de libérer un signal de détection. Le test ELISA Sandwich permet de mesurer la concentration d’un analyte dans un échantillon complexe grâce à l’antigène de capture immobilisé qui agit comme une étape de purification et confère au test une très grande spécificité. Dans un sandwich ELISA, l’anticorps de détection peut être directement conjugué à la biotine, à la HRP ou à l’AP (en jaune sur l’image ci-dessous) mais il est également possible d’utiliser un anticorps secondaire conjugué pour le détecter si l’anticorps d’enrobage provient d’une espèce hôte différente.
