Informe de caso

Ingeniería de siete formatos de anticuerpos biespecíficos con afinidades nanomolares para el cáncer de próstata

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Cliente

Biotech sueca

Sector

Terapéutica
Área de investigación

Oncología

Enfermedad objetivo

Cáncer de próstata
Procesos clave
- Selección y diseño del formato biespecífico
- Expresión y purificación
- Caracterización por ELISA y Biacore

Formatos biespecíficos diseñados

3,2x10⁻¹⁰ M

Afinidad del mejor candidato biespecífico

Contexto

Una empresa biotecnológica sueca confió en ProteoGenix para el diseño y la producción de varios formatos de anticuerpos biespecíficos. El cliente proporcionó las secuencias de dos anticuerpos monoclonales, denominados Ab1 y Ab2, que sirvieron como base para la ingeniería de los anticuerpos biespecíficos.

Para maximizar el potencial terapéutico de estos anticuerpos parentales, nuestros expertos seleccionaron siete formatos biespecíficos distintos para su diseño y desarrollo:

Ab1-Ab2-KIH
Ab1-Ab2-DEKK
Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH
Ab1-Ab2-CrossMAb-DEKK
Ab1-Ab2-DuetMab-KIH
Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK
Ab1-Ab2-Duobody

Este enfoque multiformal diseñado por nuestros expertos permitió una evaluación exhaustiva de diferentes arquitecturas moleculares para identificar el (los) candidato(s) más adecuado(s) para un mayor desarrollo.

Retos

Expresar los siete anticuerpos biespecíficos con el ensamblaje correcto

Mantener la afinidad de los anticuerpos biespecíficos generados en el mismo rango que los anticuerpos parentales

Enfoque de ProteoGenix

Genes codificantes para las proteínas objetivo

ADNc sintetizados químicamente con optimización de codones para expresión en células de mamífero

2. Subclonación en vector de expresión

Las secuencias de ADNc fueron subclonadas en el vector de expresión en células de mamífero patentado de ProteoGenix, pTXs1. Se usaron un total de 14 plásmidos de expresión para este proyecto.

3. Expresión y pruebas de purificación de anticuerpos biespecíficos recombinantes

Se preparó ADN libre de endotoxinas para cada construcción de expresión pTXs1.
Cotransfección transitoria en células propietarias XtenCHO^TM
Purificación en resina de proteína G mediante método estándar
Determinación del rendimiento tras la purificación e intercambio de buffer mediante el método UV280

4. Reacción post-producción para el formato tipo IgG usando Duobodies

Ab1-Duobody y Ab2-Duobody se recombinaron por intercambio controlado de brazos Fab impulsado por mutaciones coincidentes y condiciones de laboratorio ajustadas
La evaluación general de la calidad de los anticuerpos biespecíficos generados se realizó mediante SDS-PAGE

5. Caracterización de los diferentes formatos biespecíficos

Determinación por ELISA de la capacidad de unión de los anticuerpos biespecíficos a Ag1 y Ag2. Los anticuerpos parentales Ab1 y Ab2 también fueron analizados para comparación.
La determinación de K_D se llevó a cabo por Biacore T200 para evaluar la capacidad de unión de los formatos biespecíficos a ambos antígenos frente a los anticuerpos parentales. Los tres mejores formatos biespecíficos, determinados en el paso anterior, fueron seleccionados para la determinación de K_D: Ab1-Ab2-Duobody, Ab1-Ab2-KIH y Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH.

Resultados

Los análisis SDS-PAGE de los perfiles de purificación y los controles de calidad de las muestras finales mostraron que los formatos Ab1-Ab2-DEKK y Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK se expresan pero no se ensamblan en estructuras completas de anticuerpo biespecífico, probablemente debido a la falta de heterodimerización de cadenas pesadas. Por tanto, la mutación DEKK no parece ser un formato biespecífico óptimo para este par Ab1/Ab2 específico. Todos los demás formatos biespecíficos y los Duobodies individuales se expresaron con buen rendimiento y pureza, además de ensamblarse correctamente en estructuras completas de anticuerpo.

Cada anticuerpo biespecífico analizado pudo unirse a los antígenos, aunque los dos formatos DEKK, Ab1-Ab2-DEKK y Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK, mostraron una unión muy baja, en línea con que no se ensamblaron correctamente. En comparación con los anticuerpos parentales Ab1 y Ab2, los mejores anticuerpos biespecíficos en cuanto a unión fueron Ab1-Ab2-Duobody, Ab1-Ab2-KIH y Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH, lo que sugiere que estos constructos conservaron su capacidad de unión.

Los resultados de determinación de KD son coherentes con las valoraciones ELISA realizadas previamente. Se confirmó la unión de los tres anticuerpos biespecíficos analizados frente a cada antígeno, con alta afinidad en el rango nanomolar. Se observa una diferencia de afinidad para todos los biespecíficos respecto a los anticuerpos parentales, lo que puede explicarse por la menor avididad ya que el anticuerpo parental tiene dos sitios de unión al antígeno frente a los biespecíficos, que son monovalentes para cada antígeno.

Conclusiones clave

Los siete formatos biespecíficos seleccionados se diseñaron y expresaron con éxito frente a dos dianas de cáncer de próstata, con cinco formatos logrando el ensamblaje correcto y unión a antígenos duales.

Tres candidatos principales —Duobody, KIH y CrossMAb-KIH— fueron confirmados mediante Biacore para mantener afinidad nanomolar para ambos antígenos, alcanzando el mejor candidato 3,20×10⁻¹⁰ M.

Esto demuestra que un enfoque de cribado multiformal es una estrategia eficaz para identificar candidatos biespecíficos de alta afinidad y evitar problemas de ensamblaje como se observó con los formatos DEKK.

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