MARCAJE DE ANTICUERPOS

Marcadores comunes utilizados en el marcaje de anticuerpos

Biotina-Avidina

La avidina es una molécula que forma una de las interacciones no covalentes más fuertes con su ligando, la biotina. La formación del enlace biotina-avidina es muy rápida y extremadamente estable en diversas condiciones (pH, temperatura y otros agentes desnaturalizantes). El pequeño tamaño de la biotina es una ventaja principal en el marcaje de anticuerpos ya que no afecta las propiedades del anticuerpo marcado. Este tamaño reducido también permite que la biotina aumente la sensibilidad de un ensayo, pues una sola molécula de avidina puede unirse a 3 moléculas de biotina marcadas.

Los anticuerpos marcados con biotina se utilizan en varias técnicas como ELISA, Western blot, inmunohistoquímica, FACS, entre otras.
Existen varios métodos para biotinilar anticuerpos, sin embargo, la biotinilación de aminas primarias sigue siendo la técnica más común. En resumen, esta reacción química produce el marcaje sobre los grupos ε-amino de las lisinas accesibles químicamente usando un éster N-hidroxisuccinimida (NHS) de un análogo de biotina.

Peroxidasa de rábano picante (HRP)

La HRP (por sus siglas en inglés: Horseradish Peroxidase) es una enzima de reporte empleada habitualmente para el marcaje de anticuerpos en múltiples aplicaciones, como Western Blot, ELISA o IHC. Esta enzima se caracteriza por una alta tasa de recambio, generando así una señal intensa en un periodo breve de tiempo.

3 métodos de detección emplean comúnmente anticuerpos marcados con HRP:

• Detección colorimétrica: en presencia de peróxido de hidrógeno, la HRP cataliza la reducción de H2O2 a agua al tiempo que oxida sustratos como 4-cloro-1-naftol (4-CN), 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) o polimeriza 3′-diaminobenzidina (DAB). Estas reacciones inducen la formación de un precipitado coloreado fácilmente detectable.
• Detección por quimioluminiscencia: nuevamente, en presencia de peróxido de hidrógeno, la HRP oxida la luminol a un intermediario excitado inestable que lleva a la formación de 3′-aminoftalato y a la emisión de luz a 425 nm.
• También es posible la detección fluorescente según el sustrato utilizado.

Al igual que la biotina, la HRP puede conjugarse a los grupos ε-amino de las lisinas accesibles químicamente. También es posible unir HRP a residuos de cisteína mediante una reacción en dos pasos que implica la reducción previa de los enlaces disulfuro del anticuerpo y la adición electrofílica de un compuesto reactivo con tioles (por ejemplo, un maleimida marcado).

Isotiocianato de fluoresceína (FITC)

FITC es un derivado isotiocianato de la fluoresceína que lo hace reactivo frente a aminas primarias y grupos tiol presentes en residuos de lisina y cisteína (cuando están reducidos) de las biomoléculas, respectivamente. Generalmente se conjugan de 3 a 6 moléculas de fluoresceína por anticuerpo para evitar problemas de autoapagamiento y solubilidad.
Los colorantes fluorescentes como la fluoresceína se utilizan comúnmente en diferentes aplicaciones de laboratorio como Western Blot, citometría de flujo e inmunofluorescencia.