Case report

Ingegneria di sette formati di Anticorpi Bispecifici con lead nanomolari contro il cancro alla prostata

Scarica il case report completo Parla con i nostri esperti

Cliente

Swedish Biotech

Settore

Terapie
Dominio di ricerca

Oncologia

Malattia target

Cancro alla prostata
Processi chiave
- Scelta e design del formato bispecifico
- Espressione e purificazione
- Caratterizzazione tramite ELISA ed analisi con Biacore

Formati bispecifici progettati

3,2x10⁻¹⁰ M

Affinità del miglior candidato bispecifico

Contesto

Un’azienda biotech svedese si è affidata a ProteoGenix per la progettazione e la produzione di vari formati di anticorpi bispecifici. Il cliente ha fornito le sequenze di due anticorpi monoclonali, denominati Ab1 e Ab2, che hanno rappresentato la base per l’ingegnerizzazione degli anticorpi bispecifici.

Per ottimizzare il potenziale terapeutico di questi anticorpi parentali, sono stati selezionati dai nostri esperti sette distinti formati bispecifici:

Ab1-Ab2-KIH
Ab1-Ab2-DEKK
Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH
Ab1-Ab2-CrossMAb-DEKK
Ab1-Ab2-DuetMab-KIH
Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK
Ab1-Ab2-Duobody

Questo approccio multi-formato, pensato dai nostri esperti, ha permesso una valutazione completa delle diverse architetture molecolari per identificare il/i candidato/i più idoneo/i allo sviluppo successivo.

Le sfide

Espressione dei sette anticorpi bispecifici con una corretta assemblaggio

Mantenere l’affinità degli anticorpi bispecifici generati nello stesso intervallo di quella degli anticorpi parentali

Approccio ProteoGenix

Geni codificanti per le proteine target

cDNA chimicamente sintetizzati con ottimizzazione dei codoni per l’espressione in cellule di mammifero

2. Sottoclone nel vettore di espressione

Le sequenze di cDNA sono state sottoclone nel vettore di espressione proprietario per cellule di mammifero pTXs1 di ProteoGenix. Sono stati utilizzati 14 plasmidi espressivi per questo progetto.

3. Espressione e test di purificazione degli anticorpi bispecifici ricombinanti

Purificazione del DNA privo di endotossine per ciascuna costruzione pTXs1.
Co-transfezione transitoria in cellule proprietarie XtenCHO^TM
Purificazione su resina protein G con metodo standard
Determinazione delle rese dopo purificazione e cambio tampone tramite metodo UV280

4. Reazione post-produzione per formato IgG-like usando Duobodies

Ab1-Duobody e Ab2-Duobody sono stati ricombinati mediante scambio controllato delle braccia Fab guidato da mutazioni abbinate in condizioni di laboratorio dedicate
La valutazione generale della qualità degli anticorpi bispecifici generati è stata eseguita tramite SDS-PAGE

5. Caratterizzazione dei diversi formati bispecifici

Capacità di legame di titolazione ELISA degli anticorpi bispecifici verso Ag1 e Ag2. Anche gli anticorpi parentali Ab1 e Ab2 sono stati testati per confronto.
La determinazione di K_D è stata eseguita tramite Biacore T200 per valutare la capacità di legame dei formati bispecifici ad entrambi Ag1 e Ag2 rispetto agli anticorpi parentali. I tre migliori formati bispecifici determinati nello step precedente sono stati selezionati per la determinazione di K_D: Ab1-Ab2-Duobody, Ab1-Ab2-KIH e Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH.

Risultati

Le analisi SDS-PAGE dei profili di purificazione e delle QC finali hanno mostrato che i formati Ab1-Ab2-DEKK e Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK sono espressi ma non assemblati in strutture anticorpali bispecifiche complete, probabilmente a causa della mancata eterodimerizzazione delle catene pesanti. La mutazione DEKK quindi non sembra essere un formato bispecifico ottimale per questa specifica coppia Ab1/Ab2. Tutti gli altri formati bispecifici e i singoli Duobodies sono stati espressi con buona resa e purezza ed assemblati correttamente in strutture anticorpali complete.

Ciascun anticorpo bispecifico testato è stato in grado di legarsi agli antigeni, sebbene i due formati DEKK (Ab1-Ab2-DEKK e Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK) abbiano mostrato un legame molto basso, coerente col fatto che non si sono assemblati correttamente. Confrontando con gli anticorpi parentali Ab1 e Ab2, i migliori anticorpi bispecifici per la capacità di legame sono Ab1-Ab2-Duobody, Ab1-Ab2-KIH e Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH, indicando che queste costruzioni bispecifiche hanno mantenuto la loro capacità di legame.

I risultati della determinazione del K_D sono coerenti con le titolazioni ELISA effettuate sopra. Il legame di tutti e tre gli anticorpi bispecifici testati è confermato contro ciascun antigene con un’elevata affinità nell’intervallo nanomolare. È stata osservata una differenza di affinità per tutti gli anticorpi bispecifici rispetto agli anticorpi parentali, spiegabile dalla ridotta avidità dato che l’anticorpo parentale ha due siti di legame per l’antigene rispetto agli anticorpi bispecifici che sono monovalenti per ciascun antigene.

Key Takeway

I sette formati bispecifici selezionati sono stati progettati ed espressi con successo contro due target del cancro alla prostata, con cinque formati che hanno raggiunto una corretta assemblaggio e legame duale con antigeni.

Tre candidati principali — Duobody, KIH e CrossMAb-KIH — sono stati confermati da Biacore con un’affinità nanomolare per entrambi gli antigeni, con il miglior candidato che ha raggiunto 3,20×10⁻¹⁰ M.

Ciò dimostra che uno screening multi-formato è una strategia efficace per identificare lead di anticorpi bispecifici ad alta affinità, evitando criticità di assemblaggio come riscontrato nei formati basati su DEKK.

Vuoi saperne di più su questo progetto?

Scarica il case report completo per leggere protocolli, risultati dettagliati e altro.

Scarica ora

Servizi correlati

Sviluppo anticorpi bispecifici Servizi personalizzati di Phage Display