Fallstudie

Engineering von sieben bispezifischen Antikörper-formaten mit Nanomolar-Leads gegen Prostatakrebs

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Kunde

Schwedisches Biotech

Sektor

Therapeutika
Forschungsgebiet

Onkologie

Zielerkrankung

Prostatakrebs
Schlüsselprozesse
- Auswahl und Design des bispezifischen Formats
- Expression und Aufreinigung
- Charakterisierung mit ELISA und Biacore

Bispezifische Formate entwickelt

3,2x10⁻¹⁰ M

Affinität des besten bispezifischen Kandidaten

Kontext

Ein schwedisches Biotechnologieunternehmen beauftragte ProteoGenix mit dem Design und der Produktion verschiedener bispezifischer Antikörperformate. Der Kunde lieferte die Sequenzen von zwei monoklonalen Antikörpern, bezeichnet als Ab1 und Ab2, welche als Basis für das bispezifische Antikörper-Engineering dienten.

Um das therapeutische Potenzial dieser Ausgangsantikörper zu optimieren, wurden von unseren Experten sieben verschiedene bispezifische Formate für das Design und die Entwicklung ausgewählt:

Ab1-Ab2-KIH
Ab1-Ab2-DEKK
Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH
Ab1-Ab2-CrossMAb-DEKK
Ab1-Ab2-DuetMab-KIH
Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK
Ab1-Ab2-Duobody

Durch diesen Multi-Format-Ansatz unserer Experten konnten verschiedene molekulare Architekturen umfassend evaluiert werden, um die geeigneten Kandidaten für die Weiterentwicklung zu identifizieren.

Herausforderungen

Die Expression der sieben bispezifischen Antikörper mit korrekter Assemblierung

Die Affinität der generierten bispezifischen Antikörper im Bereich der Ausgangsantikörper halten

Vorgehen von ProteoGenix

Gene, die für Zielproteine codieren

cDNAs wurden chemisch synthetisiert und für die Expression in Säugerzellen codon-optimiert

2. Subklonierung in Expressionsvektoren

cDNA-Sequenzen wurden in den proprietären Expressionsvektor pTXs1 von ProteoGenix für Säugerzellen subkloniert. Insgesamt wurden 14 Expressionsplasmide für dieses Projekt verwendet.

3. Expression & Reinigung der rekombinanten bispezifischen Antikörper

Endotoxinfreie DNA wurde für jede pTXs1-Expressionseinheit aufgereinigt.
Transiente Ko-Transfektion in proprietäre XtenCHO^TM-Zellen
Aufreinigung über eine Protein-G-Matrix nach Standardverfahren
Bestimmung der Ausbeuten nach Reinigung und Pufferwechsel erfolgte mittels UV280-Methode

4. Post-produktiver Schritt für IgG-ähnliche Formate mit Duobodies

Ab1-Duobody und Ab2-Duobody wurden durch kontrollierten Fab-Armaustausch mit abgestimmten Mutationen unter spezifischen Laborbedingungen rekombiniert
Generelle Qualitätsbewertung der generierten bispezifischen Antikörper erfolgte anschließend mittels SDS-PAGE

5. Charakterisierung der verschiedenen bispezifischen Formate

ELISA-Titration zur Bestimmung der Bindekapazität der bispezifischen Antikörper an Ag1 und Ag2. Ab1- und Ab2-Elternantikörper wurden zum Vergleich ebenfalls getestet.
K_D-Bestimmung erfolgte über Biacore T200, um die Bindekapazität der bispezifischen Formate an beide Antigene im Vergleich zu den Elternantikörpern zu bewerten. Die drei besten Formate des vorigen Schrittes wurden hierfür ausgewählt: Ab1-Ab2-Duobody, Ab1-Ab2-KIH und Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH.

Ergebnisse

SDS-PAGE-Analysen der Aufreinigungsprofile und abschließenden Qualitätskontrollen zeigten, dass die Ab1-Ab2-DEKK- und Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK-Formate zwar exprimiert, aber nicht zu vollständigen bispezifischen Antikörperstrukturen assembliert wurden, vermutlich aufgrund fehlender Heterodimerisierung der schweren Ketten. Die DEKK-Mutation scheint somit kein optimales bispezifisches Format für dieses spezielle Ab1/Ab2-Paar zu sein. Alle anderen bispezifischen Formate und einzelnen Duobodies konnten mit guter Ausbeute und Reinheit exprimiert und korrekt in vollständige Antikörperstrukturen assembliert werden.

Jeder getestete bispezifische Antikörper konnte an die Antigene binden, wobei die beiden DEKK-Formate Ab1-Ab2-DEKK und Ab1-Ab2-DuetMab-DEKK eine sehr geringe Bindung zeigten, was im Einklang damit steht, dass sie nicht korrekt assembliert waren. Im Vergleich zu den Elternantikörpern Ab1 und Ab2 zeigten die bispezifischen Antikörper Ab1-Ab2-Duobody, Ab1-Ab2-KIH und Ab1-Ab2-CrossMAb-KIH die beste Bindung, was darauf hinweist, dass diese Formate ihre Bindung beibehalten haben.

Die Ergebnisse der K_D-Bestimmung bestätigen die zuvor durchgeführten ELISA-Titrationen. Die Bindung aller drei getesteten bispezifischen Antikörper an jedes Antigen konnte mit hoher Affinität im Nanomolar-Bereich bestätigt werden. Im Vergleich zu den entsprechenden Elternantikörpern zeigte sich eine Affinitätsdifferenz bei allen bispezifischen Antikörpern, erklärt durch die reduzierte Avidität – da die Elternantikörper zwei Bindungsstellen pro Antigen besitzen, während bispezifische Antikörper für jedes Antigen monovalent sind.

Wichtigste Erkenntnis

Die sieben ausgewählten bispezifischen Antikörperformate wurden erfolgreich gegen zwei Prostatakrebs-Zielantigene designt und exprimiert, wobei fünf Formate eine korrekte Assemblierung und eine doppelte Antigenbindung erreichten.

Drei Topkandidaten – Duobody, KIH und CrossMAb-KIH – konnten per Biacore eine Nanomolar-Affinität für beide Antigene bestätigen. Der beste Kandidat erreichte eine Affinität von 3,20×10⁻¹⁰ M.

Dies zeigt, dass ein Multi-Format-Screening eine effektive Strategie zur Identifizierung hochaffiner bispezifischer Antikörper-Leads darstellt und dabei Assemblierungsprobleme wie bei den DEKK-basierten Formaten vermieden werden.

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