Come marcare gli anticorpi
per citofluorimetria? Marcatura diretta vs. indiretta
Una delle domande più frequenti durante lo sviluppo di anticorpi per citofluorimetria (flow cytometry, FC) è: “Come scelgo tra colorazione diretta e indiretta?”. Purtroppo, non esiste una risposta univoca. Tuttavia, possiamo darti alcuni elementi di valutazione.
La colorazione diretta prevede l’utilizzo di un anticorpo primario marcato. Questo significa che la luce emessa dal fluoroforo è direttamente proporzionale alla quantità di anticorpo presente sulla cellula (o nella cellula nel caso di colorazione intracellulare) e, quindi, alla quantità del target d’interesse.
Al contrario,la colorazione indiretta è basata sull’uso di un anticorpo secondario marcato. Gli anticorpi secondari sono generalmente diretti contro gli anticorpi dell’organismo ospite degli anticorpi primari. Questo metodo ha due principali vantaggi:
- L’anticorpo primario rimane non modificato, evitando così possibili ostacoli sterici o di perdita di specificità/funzione.
- Agisce come un amplificatore del segnale poiché diversi anticorpi secondari marcati possono legarsi a un singolo anticorpo primario.
Tuttavia, va notato che l’uso di anticorpi secondari marcati limita le possibilità di multiplexing. Infatti, poiché gli anticorpi secondari sono diretti contro anticorpi di un dato organismo ospite, si legheranno a ciascun anticorpo generato da quel medesimo ospite. Di conseguenza, due anticorpi primari derivati dal topo non possono essere usati nello stesso esperimento poiché il contributo di ciascun anticorpo primario non sarebbe distinguibile.
In sintesi, gli anticorpi primari marcati sono preferibili per esperimenti che necessitano la misurazione di più parametri in parallelo (multiplexing). Gli anticorpi secondari marcati sono invece particolarmente utili per la rilevazione di target a bassa abbondanza.
