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SERVIZI DI MISURA DELL’AFFINITÀ DI LEGAME ANTICORPALE

Piattaforma unica per la determinazione del KD anticorpale

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Dopo aver sviluppato e caratterizzato oltre 3000 anticorpi monoclonali per clienti di ogni settore, ProteoGenix ha acquisito una profonda esperienza nell’analisi delle interazioni biomolecolari. Se il tuo progetto richiede una determinazione KD ad alto throughput o l’analisi di campioni grezzi (cellule, batteri…), abbiamo tutto il necessario per portare la soluzione più adatta alle tue esigenze.

GE Biacore X100 per misure di affinità di legame anticorpale SPR / GE Biacore X100 – T200 – 8K SPRi / Horiba XelPlex Octet / ForteBio Octet Red
Applicazione "Gold standard" Determinazione KD ad alto throughput Interazione anticorpo-antigene Analisi interazione biomolecolare Determinazione KD ad alto throughput Analisi interazione anticorpo-cellula Analisi interazione biomolecolare Determinazione KD ad alto throughput Analisi interazione biomolecolare
Tecnologia Surface plasmon resonance (SPR) Surface plasmon resonance imaging (SPRi) Interferometria
Principio di misura Variazione indice di rifrazione Variazione indice di rifrazione Spostamento di lunghezza d’onda
Label free Sì Sì Sì
Analisi su campioni grezzi (cellule, batteri…) No Sì Sì
Possibilità di immobilizzare proteine (oltre agli anticorpi) mantenendo la conformazione nativa No Sì No
Imaging No Sì No
Multiplexing ++ ++++ ++
Limite di rilevazione +++ +++ +
Complessità tecnica + +++ ++
Costo/anticorpo + +++ ++
Tempi di consegna 2/3 settimane 2/3 settimane 2/3 settimane

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Studio di caso 1: determinazione del KD anticorpale fra un anticorpo anti-proteina X e la proteina X espressa sulla superficie di cellule 293T tramite tecnologia SPRi (Horiba XelPlex)

Obiettivo dello studio

Un nostro cliente ci ha chiesto di misurare l’affinità di legame di un anticorpo anti-proteina X contro una proteina X di membrana espressa sulla superficie di cellule 293T. L’espressione e presentazione della proteina direttamente nella cellula ci ha permesso di presentare l’epitopo extracellulare mantenendone la conformazione nativa.

Le misurazioni sono state eseguite usando Surface Plasmon Resonance Imaging (Horiba XelPlex).

Funzionalizzazione della biochip

La biochip è stata modificata usando un classico accoppiamento tramite ammine. In breve, una superficie terminata –COOH attivata da EDC/NHS produce un estere sulfo-NHS reattivo. Questo intermedio reagisce con un’ammina primaria per formare un legame ammidico stabile.
Sono stati testati 2 diversi metodi di deposito dell’anticorpo anti-X per individuare l’approccio ottimale (dettagli nel file PDF).

Studio della specificità interazione anticorpo-cellula

Il legame specifico delle cellule con proteina X è stato testato confrontando le curve cinetiche ottenute iniettando cellule X-proteina e cellule di controllo (293T trasfettate con un plasmide vuoto) su una biochip modificata con l’anticorpo anti-proteina X.
SPRi antibody cell interaction measurement example

Il confronto tra iniezioni di cellule X-proteina e cellule di controllo su biochip modificata con l’anticorpo anti-proteina X ha mostrato chiare differenze nelle curve cinetiche in tutte le condizioni di immobilizzazione.

Pertanto, i dati ottenuti dimostrano la specificità del legame tra cellule X-proteina e anticorpo anti-proteina X.

Analisi cinetica e termodinamica dell’interazione anticorpo-cellula

Curve cinetiche sono state ottenute iniettando cellule X-proteina sulla superficie modificata con l’anticorpo anti-X a diverse concentrazioni. Il metodo di deposito scelto è quello che ha dato i migliori risultati nello studio precedente.

Thermodynamic and kinetic antibody cell affinity analysis

I parametri cinetici sono stati determinati adattando le curve a diverse concentrazioni tramite un modello di interazione 1:1. Il valore di KD anticorpale è stato ottenuto calcolando il rapporto kd/ka.
Parametri cinetici e termodinamici Parametri cinetici e termodinamici Parametri cinetici e termodinamici
ka(M-1.s-1) kd (s-1) KD (M)
Anti-X protein / cellule X-proteina 1.00.1010 2.46.10-4 2.46.10-14

Conclusione

Il legame specifico delle cellule X-proteina con l’anticorpo anti-X proteina è stato dimostrato tramite SPRi.
I segnali SPRi hanno permesso di misurare un KD apparente molto basso, interpretabile come una elevata affinità anticorpo-cellula. Questa affinità è governata principalmente da un alto tasso di associazione (ka). La configurazione multiplexing di SPRi ha permesso di immobilizzare l’anticorpo anti-X protein su un’unica biochip con due diversi metodi e a quattro concentrazioni per ogni metodo. Durante l’esperimento sono state testate 8 condizioni sperimentali e sono stati generati 282 diversi sensogrammi in una singola biochip.

Studio di caso 2: analisi KD anticorpale tramite Biacore

Obiettivo dello studio

Un cliente ci ha richiesto di misurare il KD di un’interazione anticorpo/antigene tramite Biacore. Il progetto si occupava della classificazione di affinità di 5 diversi anticorpi contro lo stesso antigene.

Setup sperimentale

L’antigene è stato immobilizzato sulla biochip ricoperta di destrano tramite chimica maleimide, formando legami tioeteri. Soluzioni di anticorpi a diverse concentrazioni sono state fatte scorrere sull’antigene. La misurazione del segnale SPR a concentrazioni anticorpali diverse ha permesso di determinare i parametri cinetici (on-rate ka, off-rate kd) e termodinamici (KD).

Misurazione affinità anticorpale
Antigen Antibody interaction measurement

L’affinità di legame anticorpo/antigene può essere dedotta dal rapporto kd/ka, consentendo la classificazione dell’affinità.
Anticorpo ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
A 4.30×104 2.24×10-4 5.21×10-9
B 1.26×105 9.08×10-4 7.23×10-9
C 6.71×105 3.85×10-4 5.73×10-10
D 6.71×105 4.03×10-4 1.59×10-9
E 6.71×105 7.97×10-4 3.72×10-9

La graduatoria dell’affinità anticorpale può essere valutata direttamente dal valore di KD: più basso è il KD, maggiore è l’affinità dell’anticorpo.Classifica KD: C<D<E<A<B
Classifica affinità: C>D>E>A>B

Conclusione

L’analisi Biacore ha portato alla conclusione che tutti e 5 gli anticorpi testati mostrano alta affinità contro l’antigene, con C che risulta il migliore per diversi motivi:

  • KD basso indica interazione forte

  • Parametri cinetici favorevoli (tasso associazione rapido e basso rate di dissociazione)

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