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ANTIKÖRPER-BINDUNGSAFFINITÄT MESSUNG

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GE Biacore X100 zur Bindungsaffinitätsmessung von Antikörpern SPR / GE Biacore X100 – T200 – 8K SPRi / Horiba XelPlex Octet / ForteBio Octet Red
Anwendung "Gold Standard" High-Throughput KD-Bestimmung Antikörper-Antigen Interaktion Analyse biomolekularer Interaktionen High-Throughput KD-Bestimmung Analyse der Antikörper-Zell-Interaktion Analyse biomolekularer Interaktionen High-Throughput KD-Bestimmung Analyse biomolekularer Interaktionen
Technologie Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) Oberflächenplasmonenresonanz-Bildgebung (SPRi) Interferometrie
Messprinzip Änderung des Brechungsindexes Änderung des Brechungsindexes Wellenlängenverschiebung
Markierungsfrei Ja Ja Ja
Rohprobenanalyse (Zellen, Bakterien…) Nein Ja Ja
Möglichkeit zur Beschichtung von Proteinen (außer Antikörpern) unter Erhalt der nativen Konformation Nein Ja Nein
Bildgebung Nein Ja Nein
Multiplexing ++ ++++ ++
Nachweisgrenze +++ +++ +
Komplexität der Technologie + +++ ++
Kosten/Antikörper + +++ ++
Bearbeitungszeit 2/3 Wochen 2/3 Wochen 2/3 Wochen

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Fallstudie 1: Antikörper KD-Bestimmung zwischen einem Anti-Protein-X-Antikörper und dem X-Protein an der Zelloberfläche von 293T-Zellen mittels SPRi-Technologie (Horiba XelPlex)

Ziel der Studie

Ein Kunde bat uns, die Bindungsaffinität eines Anti-Protein-X-Antikörpers gegen ein Transmembranprotein X, exprimiert an der Oberfläche von 293T-Zellen, zu messen. Durch die direkte Expression des Proteins in der Zelle konnte das extrazelluläre Epitop unter Erhalt der nativen Konformation präsentiert werden.

Die Messungen erfolgten mit Surface Plasmon Resonance Imaging (Horiba XelPlex).

Biochip-Funktionalisierung

Der Biochip wurde mit einer klassischen Amin-Kopplungsstrategie modifiziert. Kurz: Eine -COOH-terminierte Oberfläche wurde mit EDC/NHS aktiviert, was zu einem reaktiven Sulfo-NHS-Ester führte. Dieses Zwischenprodukt reagiert bekanntlich mit primären Aminen zu einer stabilen Amid-Bindung.
Zwei Methoden zur Ablagerung des Anti-X-Antikörpers wurden getestet, um die optimale Spotting-Variante zu finden (Details im PDF-Dokument).

Untersuchung der Spezifität der Antikörper-Zell-Interaktion

Die spezifische Bindung der X-Protein-Zellen wurde durch Vergleich der kinetischen Kurven getestet – Einspritzung von X-Protein-Zellen und Kontrollzellen (293T-Zellen mit leerem Plasmid) über einen Anti-Protein-X-Antikörper-modifizierten Biochip.
SPRi antibody cell interaction measurement example

Der Vergleich der Injektionen von X-Protein-Zellen und Kontrollzellen auf den Anti-Protein-X-Antikörper-modifizierten Biochip zeigte deutliche Unterschiede in den kinetischen Kurven, unabhängig von den Immobilisierungsbedingungen.

Die Ergebnisse belegen somit die spezifische Bindung der X-Protein-Zellen an den Anti-Protein-X-Antikörper.

Kinetische und thermodynamische Analyse der Antikörper-Zell-Interaktion

Kinetische Kurven wurden durch Injektion von X-Protein-Zellen über die Anti-X-Protein-Antikörper-modifizierte Oberfläche mit unterschiedlichen Konzentrationen erhalten. Die für die Ablagerung verwendete Methode war die, die im vorherigen Abschnitt das beste Resultat erzielt hatte.

Thermodynamic and kinetic antibody cell affinity analysis

Kinetische Parameter wurden durch Fitten der Kurven bei unterschiedlichen Konzentrationen mittels 1:1-Interaktionsmodell bestimmt. Der Antikörper-KD-Wert wurde durch Berechnung des kd/ka-Verhältnisses ermittelt.
Kinetische und thermodynamische Parameter Kinetische und thermodynamische Parameter Kinetische und thermodynamische Parameter
ka (M-1.s-1) kd (s-1) KD (M)
Anti-X-Protein / X-Protein-Zellen 1,00·1010 2,46·10-4 2,46·10-14

Fazit

Die spezifische Bindung von X-Protein-Zellen an den Anti-X-Protein-Antikörper wurde mittels SPRi nachgewiesen.
SPRi-Signale ermöglichten die Messung eines niedrigen KD-Wertes (hohe Affinität). Diese Bindungsaffinität ist vor allem durch eine hohe Assoziationsgeschwindigkeit (ka) bestimmt. Durch die Multiplex-Konfiguration der SPRi konnten der Anti-X-Protein-Antikörper auf einem Biochip mit zwei unterschiedlichen Immobilisierungsmethoden und jeweils vier Konzentrationen immobilisiert werden. Insgesamt wurden 8 verschiedene experimentelle Bedingungen getestet und 282 Sensorgramme in einem einzigen Biochip generiert.

Fallstudie 2: Antikörper KD-Studie mittels Biacore Analyse

Ziel der Studie

Ein Kunde beauftragte uns, den KD einer Antikörper/Antigen-Interaktion mittels Biacore zu messen. Das Projekt bestand aus der Affinitätsragnierung von 5 Antikörpern gegen das gleiche Antigen.

Experimenteller Aufbau

Das Antigen wurde über klassische Maleimid-Chemie an die dextranbeschichtete Biochip-Oberfläche kovalent angebunden. Antikörperlösungen unterschiedlicher Konzentration wurden über das Antigen geführt. Die Messung des SPR-Signals bei verschiedenen Konzentrationen ermöglicht die Ermittlung der kinetischen Parameter (Assoziationsrate ka, Dissoziationsrate kd) und der thermodynamischen Kennwerte (KD).

Antikörper-Affinitätsmessung
Antigen Antibody interaction measurement

Die Bindungsaffinität eines Antikörpers zum Antigen kann aus dem Verhältnis kd/ka berechnet werden, wodurch eine Affinitäts-Rangfolge erstellt werden kann.
Antikörper ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
A 4,30×104 2,24×10-4 5,21×10-9
B 1,26×105 9,08×10-4 7,23×10-9
C 6,71×105 3,85×10-4 5,73×10-10
D 6,71×105 4,03×10-4 1,59×10-9
E 6,71×105 7,97×10-4 3,72×10-9

Das Affinitätsranking der Antikörper kann direkt anhand des KD-Werts durchgeführt werden: Je niedriger der KD-Wert, desto höher die Affinität.Antikörper-KD-Reihenfolge: C<D<E<A<B
Antikörper-Affinitätsreihenfolge: C>D>E>A>B

Fazit

Die Biacore-Analyse zeigte, dass alle 5 getesteten Antikörper eine hohe Affinität gegenüber dem Antigen aufweisen. Antikörper C zeigte aus mehreren Gründen die beste Leistung:

  • Niedriger KD-Wert als Indikator für eine starke Bindung

  • Vorteilhafte kinetische Parameter (schnelle Assoziation, niedrige Dissoziation).

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