Receptores Acoplados a Proteína G
Los receptores acoplados a proteína G (GPCR) forman una familia muy numerosa de receptores en la superficie celular, representando cerca del 4 % del genoma codificante de proteínas. También son conocidos como receptores de 7 dominios transmembrana, pues atraviesan la membrana celular 7 veces, con el extremo N-terminal hacia el exterior y el C-terminal hacia el citoplasma. Los GPCR participan en numerosos procesos fisiológicos como visión, olfato, gusto, regulación hormonal y neurotransmisión. Fármacos que modulan estos receptores constituyen la mayor clase de medicamentos comercializados; más del 30% de los fármacos aprobados por la FDA van dirigidos a GPCRs.
GPCR en salud y enfermedad
Los GPCR desempeñan un papel esencial en la respuesta de células y tejidos a señales extracelulares como hormonas, neurotransmisores y estímulos sensoriales. Al activarse por un ligando, los GPCR sufren un cambio conformacional que desencadena una cascada de señales permitiendo el intercambio de GDP por GTP en la subunidad G alfa. El complejo unido a GTP se separa del receptor y activa efectores como la adenilato ciclasa, fosfodiesterasas, fosfolipasa C e incluso canales iónicos. Así se modulan los niveles intracelulares de segundos mensajeros (AMPc, diacilglicerol, sodio o calcio), provocando respuestas fisiológicas.
Alteraciones en la señalización mediada por GPCR se han relacionado con numerosas enfermedades como cáncer, desórdenes neurológicos, cardiovasculares o metabólicos. Por ejemplo, mutaciones pueden llevar a activación constitutiva del receptor y estimular el crecimiento tumoral y metástasis. Además, la desregulación de estas señales está vinculada al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer y Parkinson.
Dada su importancia en la salud humana, los GPCR constituyen una prioridad en la investigación farmacológica. Los científicos buscan nuevas formas de modular su señalización, como el desarrollo de anticuerpos GPCR personalizados que bloquean la actividad del receptor. Estas estrategias pueden derivar en terapias más específicas y eficaces, pero existen desafíos técnicos para obtener anticuerpos GPCR personalizados de alta calidad.
Desafíos al desarrollar anticuerpos anti-GPCR personalizados
La ingeniería de anticuerpos personalizados contra GPCR (G protein-coupled receptor) es compleja por varios motivos. Primero, la mayor parte de la secuencia de aminoácidos está embebida en la membrana lipídica, lo que limita los epítopos extracelulares accesibles. Además, los GPCR comparten secuencias y dominios estructurales similares, dificultando la diferenciación de GPCR específicos por parte de los anticuerpos.
En segundo lugar, los GPCR son difíciles de expresar y purificar debido a su naturaleza lipofílica. Estos antígenos tienden a formar agregados y plegarse incorrectamente, impidiendo una respuesta inmune efectiva contra epítopos conformacionales. Por ello, su expresión debe realizarse en preparaciones de membrana como micelas o nanodiscs. Alternativamente puede sobreexpresarse el GPCR en líneas celulares y emplear la célula entera como inmunógeno. Estas estrategias aseguran la presentación de GPCR correctamente plegados al sistema inmune del hospedador.
Finalmente, la baja inmunogenicidad de los GPCR dificulta aún más la producción de anticuerpos personalizados. Para superar este reto, en ProteoGenix empleamos técnicas como el acoplamiento de péptidos GPCR a proteínas portadoras inmunogénicas como la ovoalbúmina. Con esto podemos usar eficazmente la selección de células B individuales y la técnica de hibridoma y así generar anticuerpos anti-GPCR para numerosas aplicaciones experimentales.
Cómo se expresan los GPCR para fabricar anticuerpos anti-GPCR personalizados
Para superar los desafíos de solubilidad de los GPCR, se han desarrollado diferentes métodos de expresión y estabilización, tales como usar micelas, nanodiscs o líneas celulares que expresan un GPCR concreto. Estas alternativas incrementan su solubilidad, estabilidad e inmunogenicidad y aumentan la probabilidad de obtener anticuerpos de calidad.
De esta forma, inmunizar animales con nanodiscs cargados con GPCR, micelas o líneas celulares que sobreexpresen el receptor, estimula mejor la respuesta inmune y la especificidad de los anticuerpos generados. Así se obtienen monoclonales personalizados anti-GPCR de alta afinidad y especificidad.
Micelas
Las micelas son estructuras esféricas de lípidos o tensioactivos que se ensamblan en solución acuosa por su naturaleza anfifílica. Presentan un núcleo hidrofóbico y una cubierta hidrofílica, ideales para solubilizar y estabilizar proteínas integrales de membrana.
Las micelas permiten producir anticuerpos contra proteínas de membrana como los GPCR al solubilizarlas con detergentes, estabilizando la proteína. El complejo GPCR-micela se emplea como inmunógeno para obtener anticuerpos específicos.
El uso de micelas como inmunógeno tiene ventajas: estabilizan el GPCR en su conformación nativa y previenen la agregación y degradación, facilitando la obtención de anticuerpos que reconocen epítopos funcionales.
Nanodiscs
Los nanodiscs son nanoestructuras autoensambladas que han revolucionado el estudio de proteínas de membrana como los GPCR. Consisten en una bicapa lipídica rodeada por dos copias de una proteína andamio de membrana (MSP), la cual estabiliza la bicapa y permite incorporar la proteína deseada.
La MSP forma una especie de cinturón alrededor de la bicapa, creando un complejo soluble y estable que contiene el GPCR embebido. La MSP es además soluble, permitiendo el ensamblaje correcto y la presentación de epítopos funcionales a los anticuerpos.
Ventajas de los nanodiscs sobre otras técnicas: imitan el entorno de membrana natural, favorecen la presentación de epítopos y mejoran la estabilidad de los GPCR reduciendo su agregación y degradación. Finalmente, el complejo purificado puede emplearse tanto para producción de anticuerpos como para estudios posteriores.
Inmunización con célula completa
La inmunización utilizando células que sobreexpresan el GPCR de interés es una técnica destinada a obtener anticuerpos contra proteínas integrales de membrana. Se inmunizan animales con células completas con GPCR en su superficie, logrando así que los anticuerpos reconozcan epítopos conformacionales presentes solo en el receptor bien ensamblado.
Para ello, el gen del GPCR se clona en un vector y se transfecta en células HEK293 o CHO. La sobreexpresión se comprueba mediante inmunofluorescencia, citometría o Western blot. Las células se emplean después, combinadas con adyuvantes, como inmunógeno. Tras varias rondas, se evalúa la respuesta inmune y los mejores animales se seleccionan para la producción de anticuerpos.
Esta técnica permite obtener anticuerpos contra GPCRs difíciles y detectar epítopos amplios, incluidos aquellos modificados postraduccionalmente en el dominio extracelular, un blanco relevante en el desarrollo de fármacos. En resumen, la inmunización con células completas es una estrategia poderosa para generar anticuerpos contra proteínas integrales de membrana.
