G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden eine große Familie von Zelloberflächenrezeptoren und machen etwa vier Prozent des protein-kodierenden Genoms aus. Sie werden auch als 7-(transmembranale)-Domänenrezeptoren bezeichnet, da sie siebenmal die Zellmembran durchqueren, die N-Terminus extrazellulär und die C-Terminus intrazellulär gelegen. GPCRs sind an unzähligen physiologischen Prozessen, darunter Sehen, Riechen, Schmecken, Hormonregulation und Neurotransmission, beteiligt. Wirkstoffe, die diese Rezeptoren beeinflussen, bilden die größte Arzneimittelklasse auf dem Markt: Mehr als 30 % aller FDA-zugelassenen Medikamente wirken über GPCRs.
Rolle von GPCRs in Gesundheit und Krankheit
GPCRs vermitteln die Reaktion von Zellen und Geweben auf extrazelluläre Signale wie Hormone, Neurotransmitter und Sinnesreize. Nach Ligandenbindung erfahren GPCRs eine Konformationsänderung, die Signalwege aktiviert. Dabei tauscht die membranassoziierte, palmitoylierte G-Alpha-Untereinheit GDP gegen GTP, löst sich vom Rezeptor und löst die Aktivierung zahlreicher Effektoren wie Adenylatzyklase, Phosphodiesterasen, Phospholipase C oder Ionenkanäle aus. Diese Effektoren regulieren die Konzentrationen sekundärer Botenstoffe (z. B. cAMP, Diacylglycerol, Natrium- oder Calciumionen) und rufen eine physiologische Antwort hervor.
Fehlfunktionen von GPCR-Signalwegen sind an vielen Erkrankungen wie Krebs, neurologischen, kardiovaskulären und metabolischen Störungen beteiligt. Mutationen in GPCRs können zu konstitutiver Rezeptoraktivierung und Signaltransduktion führen und so Tumorwachstum sowie Metastasierung fördern. Außerdem steht die Fehlregulation von GPCR-vermittelten Signalwegen im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson.
Aufgrund ihrer Schlüsselrolle sind GPCRs ein zentrales Forschungsthema der Arzneimittelentwicklung. Forscher untersuchen neue Wege, GPCR-Signalwege zu modulieren – darunter die Entwicklung maßgeschneiderter GPCR-Antikörper, die die Rezeptorfunktion blockieren. Dieser Ansatz eröffnet Möglichkeiten für gezieltere und effektivere Therapien, bringt jedoch einige Herausforderungen bei der Herstellung entsprechender Antikörper mit sich.
Herausforderungen bei der Herstellung maßgeschneiderter GPCR-Antikörper
Maßgeschneiderte Antikörper gegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) zu entwickeln ist aus mehreren Gründen besonders schwierig. Erstens ist ein Großteil der GPCR-Aminosäuresequenz in der Lipidmembran verankert, was dazu führt, dass nur wenige extrazelluläre Epitope für Antikörper zugänglich sind. Außerdem ähneln sich die Aminosäuresequenzen und Strukturelemente vieler GPCRs, was die spezifische Unterscheidung durch Antikörper erschwert.
Zweitens ist die Expression und Reinigung von GPCRs aufgrund ihrer Lipophilie äußerst anspruchsvoll. Lipophile Antigene aggregieren leicht und können falsch falten – die Ausbildung einer Antwort auf konformationelle Epitope ist somit erschwert. Daher müssen rekombinante GPCRs zum Einsatz als Antigene über Membranpräparationen wie Mikellen oder Nanodiscs isoliert werden. Alternativ kann eine Überexpression mithilfe einer Zelllinie erfolgen. Die Wirte werden dann mit kompletten Zellen (anstatt mit gereinigtem Protein) immunisiert, um deren Immunsystem durch nativ gefaltetes GPCR zu stimulieren.
Schließlich ist die geringe Immunogenität von GPCRs eine weitere Schwierigkeit. Um diese zu überwinden, verwendet ProteoGenix Methoden wie die Erhöhung der Immunogenität durch Kopplung von GPCR-Peptiden an immunogene Carrierproteine wie Ovalbumin. So überwinden wir die Limitierungen bei der Herstellung hochqualitativer anti-GPCR-Antikörper mittels Single-B-Zell-Screening oder Hybridom-Technik und ermöglichen Antikörper, die in vielen Anwendungen funktionieren.
Wie GPCRs für maßgeschneiderte anti-GPCR-Antikörper exprimiert werden
Zur Steigerung von Löslichkeit und Stabilität entwickelt ProteoGenix Methoden zum Ausdruck von GPCRs in Mikellen, Nanodiscs oder Zelllinien mit Überexpression des gewünschten GPCR. Dadurch wird das Antigen immunogener und die Wahrscheinlichkeit steigt, hochwertige Antikörper zu gewinnen.
Tiere, die mit GPCR-beladenen Nanodiscs, Mikellen oder GPCR-überexprimierenden Zelllinien immunisiert werden, erhalten so einen spezifischeren Reiz und die resultierenden Antikörper zeichnen sich durch größere Experimentierbarkeit aus.
Mizellen
Mizellen sind sphärische Strukturen aus amphiphilen Lipiden oder Tensiden, die sich im wässrigen Milieu zu einer hydrophoben Kern- und einer hydrophilen Außenschicht organisieren. So lassen sich hydrophobe Moleküle wie Membranproteine stabilisieren und solubilisieren.
Mizellen dienen als Hilfsmittel, um beispielsweise GPCRs als Immunogen in stabilisierter Form für die Antikörperherstellung zu präsentieren.
Sie bieten folgende Vorteile: Stabilisierung des GPCRs in nativer Konformation, erhöhte Löslichkeit und Verhinderung von Aggregation.
Nanodiscs
Nanodiscs bestehen aus einer Lipiddoppelschicht, die durch zwei Membranscaffold-Proteine (MSP) stabilisiert werden – ideal für Studien an Membranproteinen wie GPCRs. Das MSP legt sich gürtelartig um die Lipidschicht, hält sie zusammen und sorgt für einen wasserlöslichen Komplex mit eingesetztem GPCR. Das stabilere Milieu ermöglicht Antikörperbildung gegen native Epitope. Die Aufreinigung erfolgt meist per Größenausschluss- oder Affinitätschromatografie. Danach ist der Komplex in nachgelagerte Analysen und für die Antikörperproduktion einsetzbar.
Immunisierung mit ganzen Zellen
Bei der Immunisierung mit GPCR-überexprimierenden Zellen werden Tiere mit ganzen Zellen immunisiert, die das gewünschte GPCR in nativer Membranumgebung präsentieren. Der GPCR-Gentransfer erfolgt in Zelllinien wie HEK293 oder CHO-Zellen. Die Überexpression wird per Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie oder Western Blot bestätigt. Danach dienen die Zellen inkl. Adjuvans als Immunogen. Nach mehreren Immunisierungen wird getestet, ob Antikörper gegen das Ziel-GPCR gebildet wurden. Erfolgreiche Tiere werden für die Antikörperproduktion weiterverwendet. Diese Methode bietet eine breite Epitopvielfalt, darunter posttranslationale Modifikationen, und ist daher für die Antikörperentwicklung gegen Membranproteine sehr leistungsfähig.
