Recettori accoppiati a proteina G
I recettori accoppiati a proteina G (GPCR) rappresentano una grande famiglia di recettori di membrana e costituiscono circa il 4% del genoma codificante per proteine. Sono noti come recettori a 7 domini transmembrana: attraversano la membrana cellulare sette volte, con il terminale N extracellulare e il terminale C rivolto verso il citoplasma. I GPCR sono coinvolti in numerosi processi fisiologici come vista, olfatto, gusto, regolazione ormonale e neurotrasmissione. I farmaci che agiscono su questi recettori costituiscono la classe più ampia in commercio: oltre il 30% di tutti i farmaci approvati da FDA bersaglia GPCR.
I GPCR nella salute e nella malattia
I GPCR svolgono un ruolo fondamentale nella risposta di cellule e tessuti a segnali extracellulari (ormoni, neurotrasmettitori, stimoli sensoriali). L’attivazione da parte di un ligando induce un cambiamento conformazionale che attiva una cascata di segnali intracellulari, permettendo alla subunità α della proteina G di scambiare GDP con GTP. La subunità α legata a GTP si dissocia dal recettore attivando a valle numerosi effettori, tra cui adenilato ciclasi, fosfodiesterasi, fosfolipasi C e canali ionici. Questi modulano la concentrazione intracellulare di secondi messaggeri come cAMP, diacilglicerolo, ioni sodio o calcio, portando a una risposta fisiologica.
Alterazioni del segnale GPCR sono associate a numerose patologie: tumori, disturbi neurologici, malattie cardiovascolari e metaboliche. Mutazioni nei GPCR possono causare un’attivazione costitutiva con proliferazione e metastatizzazione tumorale o essere legate a malattie neurodegenerative come Alzheimer o Parkinson.
Il ruolo chiave dei GPCR rende questi recettori strategici nello sviluppo di farmaci. Nuove strategie includono la produzione di anticorpi anti-GPCR personalizzati per bloccare la loro attività; queste potrebbero portare a terapie più mirate, ma la produzione di tali anticorpi è impegnativa.
Le sfide nel produrre anticorpi anti-GPCR personalizzati
L’ingegnerizzazione di anticorpi anti-GPCR personalizzati presenta diverse difficoltà: la maggior parte della sequenza aminoacidica di un GPCR è immersa nella membrana lipidica, quindi sono disponibili pochi epitopi extracellulari accessibili agli anticorpi. Inoltre i GPCR condividono sequenze e domini strutturali molto simili, rendendo difficile differenziare specifici GPCR da altri correlati.
In secondo luogo, sono proteine lipofile difficili da esprimere e purificare: aggregano e si ripiegano in modo scorretto, ostacolando la risposta immunitaria verso epitopi conformazionali. Serve quindi una produzione ricombinante tramite preparati di membrana come micelle o nanodiscs, oppure si immunizzano gli animali usando intere cellule che esprimono il GPCR desiderato. Entrambi i metodi stimolano il sistema immunitario a impegnarsi verso un GPCR correttamente ripiegato.
Infine, i GPCR presentano un’immunogenicità generalmente bassa. Per superare ciò, ProteoGenix utilizza diverse tecniche, tra cui l’accoppiamento peptidico GPCR a proteine carrier immunogeniche come ovalbumina. Questa strategia ci consente di produrre anticorpi anti-GPCR di qualità elevata usando screening cellule B singole e generazione ibridoma, ottenendo anticorpi anti-GPCR performanti in diverse applicazioni sperimentali.
Come vengono espressi i GPCR per produrre anticorpi anti-GPCR personalizzati
Per superare le problematiche di solubilità dei GPCR, sono stati sviluppati diversi metodi di espressione e stabilizzazione: GPCR in micelle, nanodiscs o cellule che li sovraesprimono. Questi metodi rendono gli antigeni GPCR più solubili, stabili e immunogenici, aumentando la produzione di anticorpi di qualità.
In questo contesto, immunizzare animali con GPCR in nanodiscs, micelle o con cellule che sovraesprimono il GPCR stimola la risposta immunitaria e migliora la specificità degli anticorpi prodotti. Tali approcci permettono di generare anticorpi monoclonali anti-GPCR personalizzati con alta specificità e affinità.
Micelle
Le micelle sono strutture sferiche di lipidi (come surfattanti) che si auto-assemblano in soluzione acquosa grazie alla loro natura anfipatica. Hanno un nucleo idrofobico e una superficie idrofila, il che permette di solubilizzare e stabilizzare proteine di membrana come i GPCR.
Nel nostro approccio, il GPCR è solubilizzato in una micella detergente stabile, andando poi a costituire l’immunogeno per la generazione di anticorpi specifici.
Usare le micelle dà diversi vantaggi: permette di mantenere il ripiegamento nativo del GPCR, favorendo epitopi funzionali, aumenta la solubilità e riduce aggregazione e degradazione proteica.
Nanodiscs
I nanodiscs sono nano-dischi lipidici autoassemblanti, usati per studiare le proteine integrali di membrana come i GPCR.
Essi sono costituiti da un doppio strato lipidico stabilizzato da due proteine scaffold di membrana (MSP), che circondano il doppio strato e permettono l’integrazione stabile della proteina-membrana al suo interno. La MSP funge da cintura stabilizzante per l’aggregato lipidico e ne consente la solubilità.
Il vantaggio principale è mimare l’ambiente di membrana della cellula, presentando gli epitopi funzionali e riducendo aggregazione o degradazione dei GPCR.
Una volta purificato il complesso proteina-nanodisco (usando cromatografia), esso viene utilizzato per la produzione di anticorpi.
Immunizzazione con cellule intere
L’immunizzazione mediante cellule che sovraesprimono GPCR permette di generare anticorpi contro i GPCR integrali di membrana. Gli animali sono immunizzati con cellule intere con GPCR espresso in superficie, garantendo un’esposizione nativa e, quindi, la generazione di anticorpi contro epitopi conformazionali assenti in altre preparazioni.
Per preparare queste cellule, il gene del GPCR è clonato ed espresso in linee cellulari (HEK293, CHO) e verificato (immunofluorescenza, citofluorimetria, Western blot). Le cellule vengono poi somministrate agli animali, spesso con adiuvanti, e la risposta anticorpale viene monitorata. Gli animali migliori sono selezionati per la produzione finale degli anticorpi.
Tale approccio è stato applicato per numerosi GPCR, anche quelli difficili con altri sistemi, e consente di ottenere anticorpi verso epitopi modificati post-traduzionalmente o localizzati sul dominio extracellulare, preziosi nello sviluppo di farmaci.
