ANTIKÖRPER-MARKIERUNG

Gängige Marker für die Antikörper-Markierung

Biotin-Avidin

Avidin ist ein Molekül, das eine der stärksten nicht-kovalenten Bindungen mit seinem Liganden Biotin eingeht. Die Biotin-Avidin-Bindung ist äußerst schnell und bleibt unter verschiedensten Bedingungen (pH, Temperatur und auch unter denaturierenden Bedingungen) stabil. Die geringe Größe von Biotin ist ein Hauptvorteil für die Antikörper-Markierung, da sie die Eigenschaften des markierten Antikörpers nicht beeinflusst. Durch diese geringe Größe kann Biotin zudem die Sensitivität eines Assays erhöhen (da ein Avidin-Molekül an 3 markierte Biotin-Moleküle binden kann).

Biotin-markierte Antikörper werden bei verschiedenen Methoden eingesetzt, etwa in ELISA, Western Blot, Immunhistochemie, FACS…
Mehrere Methoden zur Herstellung von Biotin-markierten Antikörpern existieren, wobei die primäre Amin-Biotinylierung am häufigsten angewendet wird. Vereinfacht gesagt, erfolgt dabei die Markierung des Antikörpers an den ε-Aminogruppen der chemisch zugänglichen Lysinreste mittels N-Hydroxysuccinimidester (NHS) eines Biotin-Analogons.

Meerrettichperoxidase (HRP)

HRP (Horseradish Peroxidase) ist ein Reporterenzym, das häufig zur Markierung von Antikörpern für verschiedene Anwendungen wie Western Blot, ELISA oder IHC genutzt wird. Dieses Enzym zeichnet sich durch eine hohe Umsatzrate aus und erzeugt schnell ein starkes Signal.

Es gibt drei gängige Nachweismethoden für HRP-markierte Antikörper:

• Colorimetrischer Nachweis: In Gegenwart von Wasserstoffperoxid katalysiert HRP die Reduktion von H₂O₂ zu Wasser und oxidiert dabei ein Substrat wie 4-Chlor-1-Naphthol (4-CN) oder 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) oder polymerisiert 3′-Diaminobenzidin (DAB). Alle diese Reaktionen führen zur Bildung eines leicht erkennbaren farbigen Präzipitats.
• Chemilumineszenz-Nachweis: Ebenfalls in Gegenwart von Wasserstoffperoxid oxidiert HRP Luminol zu einem instabilen angeregten Zwischenprodukt, das letztlich zur Bildung von 3′-Aminophthalat und damit zur Lichtemission bei 425 nm führt.
• Fluoreszenznachweis ist ebenfalls möglich – je nach verwendetem Substrat.

Wie Biotin kann HRP an die ε-Aminogruppen der chemisch zugänglichen Lysinreste konjugiert werden. Ebenso besteht die Möglichkeit, HRP über Cysteinreste zu koppeln – mittels einer zweistufigen Reaktion, bei der zuerst die Disulfidbrücken des Antikörpers reduziert und anschließend ein thiolreaktives (markiertes) Molekül (z. B. ein Maleimid-Derivat) angebracht wird.

Fluoresceinisothiocyanat (FITC)

FITC ist ein Isothiocyanat-Derivat von Fluorescein und reagiert daher mit primären Aminen und – bei Reduktion – auch mit Thiolgruppen in den Lysin- und Cysteinresten von Biomolekülen. Für die optimale Markierung werden in der Regel 3 bis 6 Fluorescein-Moleküle pro Antikörper konjugiert, um etwaige Quenching-Effekte und Probleme mit der Löslichkeit zu vermeiden.
Fluoreszierende Farbstoffe wie Fluorescein werden häufig bei Western Blot, Durchflusszytometrie und Immunfluoreszenz eingesetzt.