MARQUAGE D’ANTICORPS

Marqueurs courants utilisés pour le marquage d’anticorps

Biotine-Avidine

L’avidine est une molécule qui forme l’une des interactions non covalentes les plus fortes avec son ligand, la biotine. La formation de la liaison biotine-avidine est très rapide et extrêmement stable, indépendamment des conditions (pH, température et conditions dénaturantes). La petite taille de la biotine est un avantage majeur pour le marquage d’anticorps, car elle n’affecte pas les propriétés de l’anticorps marqué. Cette petite taille confère aussi à la biotine la capacité d’augmenter la sensibilité d’un test (une molécule d’avidine pouvant lier 3 biotines marquées).

Les anticorps biotinylés sont utilisés dans différentes techniques telles que l’ELISA, le Western blot, l’immunohistochimie, la cytométrie en flux (FACS)…
Plusieurs méthodes existent pour marquer un anticorps à la biotine, cependant, la biotinylation des amines primaires demeure la technique la plus répandue. En résumé, cette réaction chimique permet de marquer l’anticorps sur les groupes ε-amine des lysines accessibles chimiquement via l’utilisation d’un ester N-hydroxysuccinimide (NHS) d’un dérivé de biotine.

Peroxydase de raifort (HRP)

La HRP (Horseradish Peroxidase) est une enzyme rapporteur communément utilisée pour le marquage d’anticorps dans diverses applications (Western blot, ELISA, IHC). Cette enzyme se caractérise par un fort taux de conversion, générant rapidement un signal intense.

Trois méthodes de détection utilisent couramment les anticorps marqués à la HRP :

• Détection colorimétrique : en présence de peroxyde d’hydrogène, la HRP catalyse la réduction du H2O2 en eau en oxydant un substrat comme le 4-chloro-1-naphtol (4-CN), la TMB ou la DAB. Ces réactions produisent un précipité coloré aisément détectable.
• Détection par chimiluminescence : toujours en présence de peroxyde d’hydrogène, la HRP oxyde la luminol générant un état excité instable qui libère de la lumière à 425 nm.
• La détection fluorescente est également envisageable selon le substrat utilisé.

Comme la biotine, la HRP peut être conjuguée aux groupes ε-amine des lysines accessibles chimiquement. Il est aussi possible de coupler la HRP aux résidus cystéine grâce à une réaction en deux étapes, consistant en la réduction des ponts disulfure puis l’addition électrophile d’un composé réactif de type thiol (comme un dérivé maleimide marqué).

Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)

Le FITC (Fluorescein Isothiocyanate) est un dérivé de la fluorescéine portant un isothiocyanate, qui réagit avec les amines primaires et groupes thiol présents sur les lysines et cystéines (après réduction) des biomolécules. Habituellement, 3 à 6 molécules de fluorescéine sont conjuguées par anticorps afin d’éviter l’extinction de la fluorescence et les possibles problèmes de solubilité.
Les colorants fluorescents comme la fluorescéine sont largement utilisés en laboratoire, notamment en Western blot, cytométrie en flux et immunofluorescence.