ANTICORPS POUR CYTOMÉTRIE EN FLUX

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Livrables après paiement intégral :

• 1,9 mg d’anticorps purifié
• Une lignée cellulaire d’hybridome (4 cryotubes)
• 150 µg de protéine purifiée
• Gène dans pUC57

Quel format d’anticorps pour la cytométrie en flux ?

Anticorps polyclonaux (pAb) sont générés en immunisant un hôte avec votre antigène cible et en collectant le sérum. C’est la solution la plus économique pour produire une grande quantité d’anticorps dirigés contre une cible donnée. Si votre principal besoin est de détecter un antigène spécifique sur vos cellules, les anticorps polyclonaux peuvent être suffisants. Gardez toutefois à l’esprit que leur spécificité, inférieure à celle des anticorps monoclonaux, peut induire des liaisons non spécifiques. Ce problème peut être atténué via la conception soignée de l’antigène.

Anticorps monoclonaux (mAb) sont généralement obtenus en fusionnant les splénocytes producteurs d’anticorps monoclonaux à des cellules de myélome pour former des hybridomes. Ces hybridomes sécrètent un anticorps identique à celui de la cellule mère. Comparés aux polyclonaux, les anticorps monoclonaux permettent d’obtenir des données plus propres grâce à leur capacité à ne reconnaître qu’un unique épitope.

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Comment marquer vos anticorps
pour la cytométrie en flux ? Marquage direct ou indirect

L’une des questions les plus courantes dans le développement d’anticorps pour la cytométrie en flux est « dois-je choisir le marquage direct ou indirect ? ». Malheureusement, il n’existe pas de réponse unique à cette question. Cependant, voici quelques éléments pour orienter votre choix.

Le marquage direct consiste à utiliser un anticorps primaire conjugué. Cela signifie que la lumière émise par le fluorophore est directement proportionnelle à la quantité d’anticorps présente à la surface (ou à l’intérieur, dans le cas d’un marquage intracellulaire) des cellules et donc de la cible.

À l’inverse, le marquage indirect repose sur l’utilisation d’un anticorps secondaire marqué. Ces anticorps secondaires sont généralement dirigés contre les anticorps de l’espèce d’origine du primaire. Cette méthode présente deux avantages :

1. L’anticorps primaire reste non modifié, ce qui prévient d’un encombrement stérique ou d’une perte de spécificité/fonction
2. Effet amplificateur du signal, car plusieurs anticorps secondaires peuvent se fixer sur un seul primaire

Toutefois, l’utilisation d’anticorps secondaires marqués limite les possibilités de multiplexage. En effet, ils étant dirigés contre l’espèce d’origine, ils se lieront à tous les anticorps issus de cet hôte. Deux anticorps primaires issus de la souris ne pourront donc pas être utilisés ensemble, car leurs signaux ne pourront pas être différenciés.

En résumé, les anticorps primaires marqués sont préférés lorsqu’il s’agit de mesurer plusieurs paramètres en parallèle (multiplexage). Les secondaires marqués seront utiles pour la détection de cibles peu abondantes.

Principe de la cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technologie couramment utilisée pour la caractérisation de cellules et de particules individuelles. Un cytomètre en flux se compose de plusieurs éléments :

• Fluide de gaine : il focalise la suspension cellulaire à travers une buse fine afin de séparer les cellules. Cette séparation est cruciale pour que le faisceau laser analyse chaque cellule indépendamment. Une mauvaise séparation ou un débit trop élevé entraîne une perte d’information.
• Laser : il éclaire chaque cellule individuelle avec une lumière cohérente à une longueur d’onde spécifique. La mesure de la lumière diffusée et de la fluorescence constitue le principe essentiel de la cytométrie en flux.
• Détecteurs : ils collectent la lumière diffusée et la fluorescence. Le signal optique est dirigé vers les détecteurs via un système composé de miroirs et de filtres.

En cytométrie en flux, les cellules sont différenciées selon plusieurs paramètres issus des mesures de lumière diffusée et de fluorescence :

• Leur taille
• Leur granularité
• L’expression d’une protéine cible

Les deux premiers paramètres sont obtenus via la lumière diffusée. Celle-ci permet de discriminer divers types cellulaires sur un scattergramme (diffusion avant vs diffusion latérale). En général, l’intensité de la diffusion avant reflète le volume alors que la diffusion latérale informe sur la complexité de la structure interne.

Enfin, les cellules peuvent aussi être séparées selon l’expression d’une protéine cible. Ceci est rendu possible grâce à l’utilisation d’anticorps couplés à un marqueur fluorescent, alliant spécificité et détection optique. L’anticorps marqué se lie à une protéine ou une modification donnée et sert de traceur pour détecter les cellules cibles. Les anticorps ne se gênent pas entre eux, permettant la détection de multiples cibles en parallèle.

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