Wie sollten Sie Ihre Antikörper für die Durchflusszytometrie markieren? Direkt vs. indirekt
Eine der häufigsten Fragen bei der Entwicklung von Durchflusszytometrie-Antikörpern ist: „Wie entscheide ich mich zwischen direkter und indirekter Färbung?“ Leider gibt es keine eindeutige Antwort. Wir geben Ihnen jedoch einige Hinweise zur Entscheidungsfindung.
Direkte Färbung bezieht sich auf die Verwendung eines markierten Primärantikörpers. Das bedeutet, dass das vom Fluorophor emittierte Licht direkt proportional zur Antikörpermenge auf der Zelle (oder in der Zelle bei intrazellulärer Färbung) und somit zur Zielmenge ist.
Im Gegensatz zur direkten Färbung basiert die indirekte Färbung auf dem Einsatz eines markierten Sekundärantikörpers. Sekundäre Antikörper richten sich meist gegen die Antikörper des Wirtsorganismus des Primärantikörpers. Diese Methode bietet zwei Hauptvorteile:
- Der Primärantikörper bleibt unverändert und minimiert so das Risiko einer möglichen sterischen Behinderung oder eines Spezifitäts-/Funktionsverlustes
- Sie dient als Signalverstärker, da mehrere markierte Sekundärantikörper an einen Primärantikörper binden können.
Zu beachten ist jedoch, dass der Einsatz markierter Sekundärantikörper die Möglichkeiten für Multiplexing einschränkt. Da Sekundärantikörper gegen die Antikörper eines Wirtsorganismus gerichtet sind, binden sie an jeden Antikörper, der vom gleichen Wirt stammt. Konkret heißt das, zwei Primärantikörper von der Maus können nicht im selben Experiment verwendet werden, da sich deren Signal nicht unterscheiden lässt.
Zusammengefasst: Markierte Primärantikörper sind für Experimente zu bevorzugen, in denen mehrere Parameter parallel gemessen werden müssen (Multiplexing). Markierte Sekundärantikörper sind besonders hilfreich für den Nachweis von Zielproteinen mit geringer Abundanz.
