MARCATURE ANTICORPI

Tag comuni usati nella marcatura degli anticorpi

Biotina-Avidina

L’avidina è una molecola che forma una delle interazioni non covalenti più forti con il suo ligando, la biotina. Il legame biotina-avidina si forma molto rapidamente ed è estremamente stabile indipendentemente dalle condizioni (pH, temperatura o altre condizioni denaturanti). La piccola dimensione della biotina è un vantaggio fondamentale per la marcatura anticorpale, poiché non altera le proprietà dell’anticorpo marcato. Questa dimensione ridotta conferisce inoltre alla biotina la capacità di aumentare la sensibilità di un saggio (poiché una molecola di avidina può legare fino a 3 molecole di biotina marcata).

Gli anticorpi marcati con biotina vengono utilizzati in svariate tecniche come ELISA, Western blot, Immunoistochimica, FACS…
Esistono diversi metodi per marcare gli anticorpi con biotina; tuttavia, la biotinilazione su residui di ammine primarie resta la tecnica più comune. In breve, questa reazione chimica permette di marcare l’anticorpo sui gruppi ε-ammino delle lisine accessibili, tramite l’uso di un estere N-idrossisuccinimmide (NHS) di un analogo della biotina.

Perossidasi di Rafano (HRP)

La HRP (Horseradish Peroxidase) è un enzima reporter ampiamente utilizzato per la marcatura di anticorpi in molteplici applicazioni, come Western Blot, ELISA o IHC. Questo enzima è caratterizzato da un alto turnover che consente di generare un segnale intenso in tempi molto brevi.

Tre metodi di rilevazione utilizzano comunemente anticorpi marcati con HRP:

• Rilevazione colorimetrica: in presenza di perossido di idrogeno, HRP catalizza la riduzione di H2O2 in acqua ossidando contemporaneamente un substrato come il 4-cloro-1-naftolo (4-CN) o il 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) o polimerizzando la 3′-diaminobenzidina (DAB). Queste reazioni provocano la formazione di un precipitato colorato facilmente rilevabile.
• Rilevazione chemioluminescente: sempre in presenza di perossido di idrogeno, HRP ossida la luminolo generando uno stato eccitato instabile che porta alla formazione di 3′-amminoftalato, con emissione di luce a 425 nm.
• La rilevazione fluorescente è possibile a seconda del substrato utilizzato.

Come la biotina, anche la HRP può essere coniugata ai gruppi e-ammino delle lisine accessibili chimicamente. È inoltre possibile collegare la HRP ai residui di cisteina attraverso una reazione in due passaggi che prevede prima la riduzione dei ponti disolfuro dell’anticorpo e poi l’aggiunta elettrofila di un composto reattivo per i tioli (ad esempio un maleimide marcato).

Isotiocianato di Fluoresceina (FITC)

Il FITC (Fluorescein Isothiocyanate) è una derivato isotiocianato della fluoresceina che lo rende reattivo verso i gruppi amminici primari e i gruppi tiolici presenti sulle lisine e cisteine (quando ridotte) delle biomolecole. In genere, si coniugano da 3 a 6 molecole di fluoresceina per anticorpo, per evitare fenomeni di quenching e problemi di solubilità.
I coloranti fluorescenti come la fluoresceina sono comunemente utilizzati in diverse applicazioni di laboratorio, tra cui Western Blot, citofluorimetria a flusso e immunofluorescenza.