SÉQUENÇAGE D'ANTICORPS DE NOVO

Vous devez séquencer votre anticorps mais vous ne disposez plus de l’hybridome ? Confiez-nous la détermination de sa séquence d’acides aminés grâce à notre service de séquençage d’anticorps de novo. Avec notre plateforme de séquençage de pointe, 100 μg d’échantillon à 90 % de pureté suffisent pour fournir une séquence complète et fonctionnelle en seulement 3 semaines.

Quels sont les avantages du séquençage d’anticorps de novo
comparé au séquençage classique ?

Le séquençage d’anticorps de novo offre des avantages uniques par rapport au séquençage classique des anticorps à partir d’hybridomes :

• Il rend possible le séquençage d’anticorps sans hybridome. Alors que le séquençage classique s’applique aux hybridomes, le séquençage d’anticorps de novo ne nécessite que quelques microgrammes de protéine. Ainsi, même si l’hybridome est perdu, la récupération de votre anticorps n’est plus un problème ! La séquence peut être déduite directement de l’anticorps et produite ensuite par expression transitoire ou expression stable.
• Il permet la caractérisation des modifications post-traductionnelles (et donc de vérifier l’intégrité et l’efficacité de l’anticorps). Ceci n’est pas possible avec le séquençage par l’ADN.
• Procédé adaptable au séquençage à haut débit : idéale pour le séquençage de centaines d’anticorps.
• S’applique à tous les formats d’anticorps sans limite d’espèce. Nous pouvons séquencer IgA, IgM, IgG, IgY, Fab, scFv de souris, rats, lapins…

Vous êtes dans une situation où le séquençage par ADN classique n’est pas possible ? Contactez-nous pour discuter de votre projet !

Il existe de nombreux cas où le séquençage classique d’anticorps à partir d’une lignée cellulaire hybridome n’est pas possible. Si vous possédez même moins de 1 mg de votre anticorps (pureté > 90 %), ProteoGenix peut déterminer sa séquence exacte grâce à notre service de séquençage d’anticorps de novo. Notre plateforme de séquençage d’anticorps de novo, à la pointe de la technologie, combine les dernières avancées en spectrométrie de masse et les logiciels les plus avancés en séquençage de protéines de novo. Notre procédure standard inclut :

• Digestion enzymatique de la protéine anticorps pour obtenir des peptides courts et chevauchants.
• LC-MS/MS de chaque peptide.
• Traitement des données incluant l’identification peptidique de novo et l’assemblage automatisé des peptides chevauchants.
• Livraison d’un rapport complet de séquençage protéique d’anticorps.
• Optionnel : test d’expression + test d’interaction anticorps/antigène

En tant qu’expert de la production d’anticorps, ProteoGenix peut rétro-traduire la séquence d’acides aminés obtenue en un gène et l’utiliser comme matière première pour l’expression transitoire ou stable de votre anticorps. Ce service peut s’intégrer dans un processus complet de développement d’anticorps, incluant l’optimisation de la production. Pour en savoir plus sur nos capacités, contactez nos chefs de projet PhD.

Détermination leucine / isoleucine

La distinction entre la leucine et l’isoleucine est particulièrement importante dans le cadre du séquençage d’anticorps de novo. En effet, leur permutation dans la région CDR ou à proximité peut impacter fortement l’affinité et la spécificité de votre futur anticorps recombinant.
Pendant longtemps, la dégradation d’Edman était l’approche de référence pour le séquençage et la détermination leucine/isoleucine. Aujourd’hui, les techniques modernes de spectrométrie de masse (MS) sont plus sensibles, rapides (et donc économiques) et permettent la caractérisation de peptides plus longs et modifiés. La difficulté principale réside dans la discrimination précise entre isoleucine et leucine. Les technologies de fragmentation avancées, comme la dissociation par transfert d’électrons à haute énergie, permettent de résoudre ce problème en générant différents ions w pour la leucine et l’isoleucine :

• L’ion z.– avec la leucine se transforme en ion w– par perte de radical isopropyle.
• L’ion z.– avec isoleucine en N-terminal devient un ion w– via perte d’un radical éthyle ou méthyle.

Ainsi, les ions w issus de la fragmentation des chaînes latérales de la leucine et isoleucine sont caractérisés par une masse distincte, observable en spectrométrie. Cette technologie, couplée à l’utilisation d’enzymes de digestion classiques et à l’analyse statistique des séquences homologues dans les bases de données d’anticorps, permet d’attribuer chaque résidu d’acide aminé avec une grande fiabilité.
Notre service prend en compte l’ensemble de ces paramètres et permet une caractérisation ultra précise de la séquence d’anticorps, même dans la région CDR.

Qu’est-ce que le séquençage de novo d’anticorps ?

Le séquençage d’anticorps de novo désigne l’obtention de leur séquence d’acides aminés sans accès à l’ARNm ni hybridome. Le principe du séquençage de novo consiste à exploiter la différence de masse entre deux ions fragments pour déterminer la masse d’un résidu dans une séquence peptidique. Comme la plupart des acides aminés ont une masse unique (sauf leucine et isoleucine), il est ainsi théoriquement possible de déduire la séquence peptidique.
En pratique, l’interprétation des spectres MS/MS commence par l’attribution des ions y et b. Celle-ci requiert l’analyse d’un expert ou d’un logiciel de séquençage de novo. Pendant longtemps, le séquençage de novo des anticorps était long et complexe. Cependant, les récents algorithmes (comme PEAKS et NOVOR) ont considérablement amélioré l’analyse des spectres MS/MS bruts, bien que certaines difficultés subsistent :

• Présence de modifications post-traductionnelles compliquant l’attribution des masses
• Présence de résidus de masse similaire (leucine et isoleucine)
• Présence de pics parasites
• Absence d’ions fragments

et ces obstacles peuvent entraîner des incertitudes dans la caractérisation du peptide, donc de la séquence exacte d’anticorps.
Grâce aux dernières technologies en séquençage de protéines d’anticorps, ProteoGenix lève ces obstacles et garantit une précision d’au moins 90 % de la séquence. Vous souhaitez séquencer votre anticorps ? Contactez nos chefs de projet PhD et laissez-nous prendre en main votre projet.