GENERAZIONE ANTICORPI POLICLONALI

Produzione di anticorpi policlonali da ProteoGenix: FAQ

Quali tipi di antigeni potete utilizzare per la produzione di anticorpi policlonali?

Abbiamo la capacità di produrre qualsiasi tipo di antigene nei nostri laboratori, inclusi peptidi, proteine, DNA, piccole molecole e cellule che sovraesprimono l’antigene desiderato. Possiamo produrre anticorpi policlonali anche con antigeni forniti dal cliente.

Come si può ottimizzare il processo di produzione di anticorpi policlonali?

Progettazione e produzione dell’antigene (Antigen Design And Production)

Per ottenere alti titoli di anticorpi specifici serve un antigene in grado di scatenare una forte risposta immunitaria. Scegliere l’antigene giusto resta uno degli step fondamentali per la produzione di anticorpi policlonali.

Possono essere utilizzati diversi antigeni per la generazione di anticorpi policlonali, tra cui:

• Proteine – antigeni convenzionali per la generazione di anticorpi. Le proteine consentono agli anticorpi policlonali di riconoscere vari epitopi nelle conformazioni native.
• Peptidi – utili quando si devono ottenere anticorpi verso epitopi lineari (es. Western Blot) o verso uno specifico epitopo (migliora la specificità del test). La maggior parte dei peptidi non è immunogenica, quindi si utilizzano adiuvanti.
• DNA – l’immunizzazione genetica è impiegata in casi particolari, ad esempio se la proteina target è difficile da produrre, instabile o con domini transmembrana complessi.

Anche piccole molecole o cellule intere possono essere usate per l’immunizzazione, ma progetti di questo tipo richiedono soluzioni personalizzate e test dedicate.

Immunizzazione animale (Animal Immunization)

Il protocollo standard di immunizzazione prevede:

• 51 giorni per la produzione di anticorpi policlonali anti-proteina
• 70 giorni per la produzione di anticorpi policlonali anti-peptide

Entrambi i protocolli possono essere estesi se i titoli anticorpali minimi non vengono raggiunti. Di norma, è meglio immunizzare animali con meno antigene per periodi prolungati, invece che usare più antigene in tempi brevi.

Purificazione degli anticorpi policlonali (Polyclonal Antibody Purification)

Gli anticorpi policlonali vengono recuperati dal sangue degli animali una volta raggiunto il titolo desiderato. La frazione cellulare e la parte sierica ricca di anticorpi vengono separate per centrifugazione, ottenendo una soluzione cruda di anticorpi policlonali.

La preparazione cruda è utile per molte applicazioni, ma per aumentare la sensibilità e ridurre i legami aspecifici è bene purificarla. La purificazione degli anticorpi policlonali può avvenire tramite:

• Purificazione con proteina A o G – Queste proteine sono prodotte rispettivamente da Staphylococcus aureus e Streptococcus spp. e legano il frammento Fc degli anticorpi con alta affinità. Questo metodo separa le immunoglobuline dalle altre componenti sieriche, ma non elimina gli anticorpi aspecifici a bassa affinità.
• Purificazione antigene-specifica – L’affinità cromatografica consente di recuperare solo anticorpi con alta affinità per un antigene specifico, riducendo i legami aspecifici e il background nei test.

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Come vengono misurati i titoli anticorpali?

Monitoriamo la risposta immunitaria prelevando regolarmente campioni dagli animali immunizzati per misurare i titoli anticorpali. Di norma utilizziamo ELISA, ma su richiesta si può effettuare la verifica anche tramite Western Blot.

Anticorpi policlonali

Cosa sono gli anticorpi policlonali?

Gli anticorpi policlonali sono una miscela di anticorpi monoclonali prodotti da vari cloni di cellule B. Di conseguenza, questi anticorpi presentano diversa specificità per gli epitopi e affinità di legame. Questa caratteristica li rende molto sensibili verso marker poco abbondanti ed efficaci nel riconoscere target complessi.

Come vengono classificati gli anticorpi policlonali?

Per via della loro diversità, gli anticorpi policlonali si classificano sulla base della specie ospite e dell’antigene utilizzato per generarli. In genere sono prodotti in coniglio, capra e pecora. I policlonali di coniglio sono molto frequenti perché il sistema immunitario di questo animale genera anticorpi ad alta affinità in quantità abbondanti rispetto ad altre specie.
Gli anticorpi policlonali vengono anche denominati secondo questa classificazione. Ad esempio, un anticorpo anti-topo di coniglio (anti-mouse rabbit polyclonal antibody) è progettato per legare IgG murine ed è prodotto in coniglio.

Quali sono i principali vantaggi e usi degli anticorpi policlonali?

Gli anticorpi policlonali sono una miscela di anticorpi monoclonali con diversa specificità ed affinità verso gli epitopi. Sono generati immunizzando animali con un target specifico (proteina, peptide, DNA, ecc.) e raccolti dal siero tramite purificazione dopo il consolidamento della risposta immunitaria.

A differenza dei monoclonali, noti per la loro elevata specificità e selettività, i policlonali sono noti per la loro sensibilità aumentata. Questo li rende strumenti preziosi per molteplici applicazioni di ricerca (di base, medica ecc.), terapia e diagnostica. Sono particolarmente utili per rilevare marker presenti in bassa quantità, tossine e altre sostanze. Il rilevamento di questi marker rari è di grande utilità nella progettazione di strumenti diagnostici precoci, monitoraggio alimentare e per catturare target rari da analizzare successivamente.

In terapia, i sieri policlonali sono fondamentali per gestire condizioni acute complesse come l’avvelenamento da morso di serpente. I veleni causano reazioni acute e sono composti da molte proteine che partecipano alla patogenesi. Una terapia efficace deve riconoscere gli antigeni e gli epitopi presenti nel veleno per bloccare i meccanismi patogeni e limitare le reazioni avverse.

Dal punto di vista tecnico, i policlonali sono più economici dei monoclonali e i tempi di produzione sono più brevi. Le limitazioni principali sono la difficoltà di scalare la produzione e l’elevata variabilità batch-to-batch. Quest’ultima può essere mitigata prevedendo controlli positivi e negativi e standard in ogni test.

Il superamento dei limiti di scalabilità è più complesso, ma ci sono soluzioni interessanti: una è la purificazione degli anticorpi IgY dal tuorlo d’uovo tramite liquidi ionici. Grazie a metodi di raccolta non invasivi e tecniche di purificazione più economiche, queste molecole potranno sostituire sempre più frequentemente altri anticorpi policlonali in molte applicazioni.

Quali sono i vantaggi dell’uso combinato di anticorpi monoclonali e policlonali?

Gli anticorpi policlonali possono essere usati singolarmente o in combinazione con i monoclonali in vari test. L’applicazione più comune è l’ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Qui, gli anticorpi monoclonali (primari) legano uno specifico target, mentre i policlonali (secondari) si legano agli anticorpi primari.

Nel test, gli anticorpi primari sono “naked” (senza tag), mentre i secondari sono marcati con un enzima. Questo permette l’amplificazione del segnale di rilevazione abbassando i limiti di sensibilità. L’amplificazione avviene grazie al fatto che, mentre ciascun anticorpo primario lega solo un epitopo, molti secondari possono legarsi a più regioni dei primari. In questo modo, più anticorpi secondari possono rivestire la superficie del primario, potenziando il segnale.

L’alta sensibilità di queste molecole presenta alcune difficoltà, ad esempio la tendenza dei policlonali a legare bersagli non specifici con possibili falsi positivi. Per superare questa problematica è importante sottoporre i policlonali a processi di purificazione più rigorosi (purificazione antigene-specifica). Inoltre, l’uso di controlli e standard aiuta a determinare la reale soglia di rilevazione.