MARQUAGE D’ANTICORPS

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Marquages courants utilisés pour le marquage d’anticorps

Biotine-Avidine

L’avidine est une molécule formant l’une des interactions non covalentes les plus fortes avec son ligand, la biotine. La liaison Biotine-Avidine est rapide et reste très stable quelles que soient les conditions (pH, température…). La petite taille de la biotine est un atout majeur pour le marquage d’anticorps, car elle n’affecte pas les propriétés de l’anticorps marqué. Cette petite taille confère également à la biotine la capacité d’augmenter la sensibilité d’un test (une molécule d’avidine peut lier 3 biotines marquées).

Les anticorps marqués à la biotine sont utilisés dans de nombreuses techniques telles que l’ELISA, le Western blot, l’immunohistochimie (IHC), la cytométrie en flux (FACS)…
Plusieurs méthodes permettent de marquer les anticorps par la biotine. La biotinylation des amines primaires reste cependant la plus courante. Cette réaction chimique permet de marquer les groupes ε-amine des lysines accessibles chimiquement par un ester N-hydroxysuccinimide (NHS) d’un dérivé analogue de la biotine.

Peroxydase de raifort (HRP)

La HRP (Horseradish Peroxidase) est une enzyme de révélation couramment utilisée pour le marquage d’anticorps dans différentes applications (Western Blot, ELISA, IHC). Elle possède un taux de conversion élevé permettant l’obtention d’un signal intense et rapide.

Trois méthodes de détection courantes utilisent des anticorps marqués à la HRP :

Détection colorimétrique : en présence de peroxyde d’hydrogène, la HRP catalyse la réduction de H₂O₂ en eau tout en oxydant des substrats tels que le 4-chloro-1-naphtol (4-CN), la TMB (3,3’,5,5’-Tétraméthylbenzidine) ou en polymérisant la DAB (3’-diaminobenzidine). Ces réactions forment un précipité coloré facilement détectable.
Détection par chimiluminescence : là encore, en présence de peroxyde d’hydrogène, la HRP oxyde la luminol formant un état excité instable qui aboutit à l’émission de lumière à 425nm.
La détection par fluorescence est également possible selon le substrat utilisé.

Comme pour la biotine, la HRP peut être conjuguée aux groupes ε-amine des lysines accessibles de façon chimique. Il est aussi possible de la lier aux cystéines grâce à une réaction en deux étapes, passant par la réduction des ponts disulfures de l’anticorps puis l’addition d’un composé thiol réactif (ex : un maleimide marqué).

Isothiocyanate de fluorescéine (FITC)

Le FITC (Fluorescein Isothiocyanate) est un dérivé isothiocyanate de la fluorescéine, ce qui le rend réactif vis-à-vis des amines primaires et des groupes thiols présents au niveau des résidus de lysine et de cystéine (si réduits) des biomolécules. En général, 3 à 6 molécules de fluorescéine sont conjuguées par anticorps afin d’éviter la désactivation du signal ou des problèmes de solubilité.
Les colorants fluorescents comme la fluorescéine sont largement utilisés en Western Blot, cytométrie en flux et immunofluorescence en laboratoire.