MARCAJE DE ANTICUERPOS

Marcadores comunes usados en el marcaje de anticuerpos

Biotina-Avidina

La avidina es una molécula que forma una de las interacciones no covalentes más fuertes con su ligando, la biotina. La formación del enlace biotina-avidina es muy rápida y muy estable independientemente de las condiciones (pH, temperatura y otras condiciones desnaturalizantes). El pequeño tamaño de la biotina es una gran ventaja para el marcaje de anticuerpos, ya que no afecta las propiedades del anticuerpo marcado. Este tamaño reducido también otorga a la biotina la capacidad de aumentar la sensibilidad de un ensayo (ya que una molécula de avidina puede unirse a 3 moléculas de biotina marcadas).

Los anticuerpos marcados con biotina se utilizan en varias técnicas como ELISA, Western blot, inmunohistoquímica, FACS…
Existen varios métodos para marcar anticuerpos con biotina; sin embargo, la biotinilación de aminas primarias sigue siendo la técnica más común. En resumen, esta reacción química produce el marcaje del anticuerpo en los grupos ε-amino de las lisinas químicamente accesibles mediante el uso de un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de un análogo de biotina.

Peroxidasa de rábano picante (HRP)

La HRP (horseradish peroxidase) es una enzima reportera usada comúnmente para el marcaje de anticuerpos en múltiples aplicaciones, como Western Blot, ELISA o IHC. Esta enzima se caracteriza por una alta tasa de recambio, permitiendo generar una señal intensa en poco tiempo.

Existen tres métodos de detección habituales para anticuerpos marcados con HRP:

• Detección colorimétrica: en presencia de peróxido de hidrógeno, la HRP cataliza la reducción de H2O2 a agua, oxidando un sustrato como 4-cloro-1-naftol (4-CN) o 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB), o polimerizando 3′-diaminobencidina (DAB). Todas estas reacciones producen un precipitado coloreado fácilmente detectable.
• Detección quimioluminiscente: nuevamente, en presencia de peróxido de hidrógeno, la HRP oxida la luminol a un intermedio excitado inestable que da lugar a la formación de 3′-aminoftalato y a la emisión de luz a 425 nm.
• La detección fluorescente también es posible dependiendo del sustrato utilizado.

Al igual que la biotina, la HRP puede conjugarse a los grupos ε-amino de las lisinas accesibles químicamente. También es posible enlazar la HRP a residuos de cisteína mediante una reacción en dos pasos, que implica la reducción de los enlaces disulfuro del anticuerpo y la adición electrofílica de un compuesto tiol-reactivo (por ejemplo, un maleimida marcado).

Isotiocianato de fluoresceína (FITC)

FITC (fluorescein isothiocyanate) es un derivado isotiocianato de la fluoresceína que lo hace reactivo frente a aminas primarias y grupos tiol presentes en los residuos de lisina y cisteína (cuando están reducidos) de biomoléculas, respectivamente. Habitualmente, se conjugan entre 3 y 6 moléculas de fluoresceína por anticuerpo para evitar fenómenos de quenching y problemas de solubilidad.
Los colorantes fluorescentes como la fluoresceína se utilizan frecuentemente en diversas aplicaciones de laboratorio como Western Blot, citometría de flujo e inmunofluorescencia.