MARCAJE DE ANTICUERPOS

Etiquetas comunes usadas en el marcaje de anticuerpos

Biotina-Avidina

Avidina es una molécula que forma una de las interacciones no covalentes más fuertes con su ligando, la biotina. La formación del enlace biotina-avidina es muy rápida y muy estable independientemente de las condiciones (pH, temperatura y otras condiciones desnaturalizantes). El pequeño tamaño de la biotina es una ventaja principal para el marcaje de anticuerpos, ya que no afecta las propiedades del anticuerpo marcado. Este tamaño pequeño también le confiere a la biotina la capacidad de aumentar la sensibilidad de un ensayo (una molécula de avidina puede unirse a 3 moléculas de biotina marcadas).

Los anticuerpos marcados con biotina se usan en numerosas técnicas como ELISA, Western blot, inmunohistoquímica, FACS, entre otras.
Existen varios métodos para obtener anticuerpos marcados con biotina; sin embargo, la biotinilación de aminas primarias sigue siendo la técnica más común. Brevemente, esta reacción química permite marcar el anticuerpo en los grupos ε-amino de las lisinas accesibles químicamente, utilizando un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) de un análogo de biotina.

Peroxidasa de rábano picante (HRP)

HRP (Horseradish Peroxidase) es una enzima reportera comúnmente usada para el marcaje de anticuerpos en aplicaciones como Western Blot, ELISA o IHC. Esta enzima se caracteriza por una alta tasa de recambio, permitiendo generar una señal intensa en poco tiempo.

Tres métodos de detección son comúnmente usados con anticuerpos marcados con HRP:

• Detección colorimétrica: en presencia de peróxido de hidrógeno, la HRP cataliza la reducción de H2O2 a agua mientras oxida un sustrato como 4-cloro-1-naftol (4-CN) o 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) o polimeriza 3′-diaminobenzidina (DAB). Todas estas reacciones inducen la formación de un precipitado coloreado fácilmente detectable.
• Detección quimioluminiscente: de nuevo, en presencia de peróxido de hidrógeno, la HRP oxida la luminol a un estado intermedio excitado e inestable, dando lugar a la formación de 3′-aminoftalato y a la emisión de luz a 425 nm.
• La detección fluorescente también es posible según el sustrato utilizado.

Al igual que la biotina, la HRP puede conjugarse a los grupos e-amino de las lisinas accesibles químicamente. También es posible unir HRP a residuos de cisteína mediante una reacción en dos pasos que implica, primero, la reducción de los enlaces disulfuro del anticuerpo y, después, la adición electrofílica de un compuesto reactivo con tiol (p. ej., un maleimida marcado).

Isotiocianato de Fluoresceína (FITC)

FITC es un derivado isotiocianato de la fluoresceína, que lo hace reactivo hacia aminas primarias y grupos tiol presentes en los residuos de lisina y cisteína (cuando están reducidos) de biomoléculas, respectivamente. Normalmente, se conjugan de 3 a 6 moléculas de fluoresceína por anticuerpo para evitar problemas de extinción y solubilidad.
Los colorantes fluorescentes como la fluoresceína se usan comúnmente en varias aplicaciones de laboratorio como Western Blot, citometría de flujo e inmunofluorescencia.