MARCATURA ANTICORPALE

Tag comuni per la marcatura degli anticorpi

Biotina-Avidina

L’avidina è una molecola che forma una delle interazioni non covalenti più forti con il suo ligando, la biotina. Il legame biotina-avidina si forma rapidamente ed è molto stabile indipendentemente dalle condizioni (pH, temperatura e condizioni denaturanti). La piccola dimensione della biotina è un notevole vantaggio per la marcatura anticorpale, poiché non altera le proprietà dell’anticorpo marcato. Inoltre, questa dimensione ridotta consente alla biotina di aumentare la sensibilità di un saggio (dato che una molecola di avidina può legare fino a 3 biotine marcate).

Gli anticorpi marcati con biotina sono utilizzati in diverse tecniche come ELISA, Western blot, immunoistochimica, FACS…
Per ottenere anticorpi marcati con biotina esistono diversi metodi, ma la biotinilazione su ammine primarie è la tecnica più comune. Questa reazione chimica consente di marcare l’anticorpo sui gruppi ε-amminici delle lisine accessibili utilizzando un estere N-idrossisuccinimidico (NHS) di un analogo della biotina.

Perossidasi di rafano (HRP)

HRP (Horseradish Peroxidase) è un enzima di rivelazione ampiamente usato per la marcatura degli anticorpi in molte applicazioni come Western Blot, ELISA o IHC. Questo enzima è caratterizzato da un’elevata velocità di turnover che permette di generare un segnale forte in tempi rapidi.

Sono comuni tre metodi di rilevazione con anticorpi marcati HRP:

• Rilevazione colorimetrica: in presenza di perossido di idrogeno, HRP catalizza la riduzione di H2O2 ad acqua mentre ossida un substrato come 4-cloro-1-naftolo (4-CN) o 3,3′,5,5′-Tetrametilbenzidina (TMB) oppure polimerizza la 3′-diaminobenzidina (DAB). Tutte queste reazioni provocano la formazione di un precipitato colorato, facilmente rilevabile.
• Rilevazione chemiluminescente: ancora in presenza di perossido di idrogeno, HRP ossida la luminolo in uno stato eccitato instabile generando 3′-aminoftalato e emissione luminosa a 425 nm.
• È inoltre possibile la rilevazione fluorescente, in base al substrato impiegato.

Come la biotina, anche HRP può essere coniugata ai gruppi ε-amminici delle lisine accessibili chimicamente. È inoltre possibile legare HRP a residui di cisteina grazie a una reazione in due stadi che prevede la riduzione dei ponti disolfuro dell’anticorpo e l’addizione elettrofila di un composto reattivo verso i tioli (come un maleimide marcato).

Isotiocianato di fluoresceina (FITC)

FITC (Fluorescein Isothiocyanate) è un derivato isotiocianato della fluoresceina che lo rende reattivo verso ammine primarie e gruppi tiolici, presenti rispettivamente sui residui di lisina e cisteina (quando ridotta) delle biomolecole. Di solito, vengono coniugate da 3 a 6 molecole di fluoresceina per anticorpo, per evitare fenomeni di quenching e problemi di solubilità.
I coloranti fluorescenti come la fluoresceina sono comunemente usati in laboratorio per Western Blot, citofluorimetria a flusso e immunofluorescenza.