Warum ProteoGenix der richtige Partner für Ihre Antikörper-Markierung ist

 

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Gängige Marker bei der Antikörper-Markierung

Biotin-Avidin

Avidin bildet eine der stärksten nicht-kovalenten Bindungen mit seinem Liganden Biotin. Die Biotin-Avidin-Bindung erfolgt sehr schnell und bleibt unter verschiedensten Bedingungen (pH, Temperatur, Denaturierung) stabil. Das geringe Molekulargewicht von Biotin ist ein zentraler Vorteil für die Antikörper-Markierung, da dadurch die Eigenschaften des markierten Antikörpers nicht beeinflusst werden. Zudem kann Biotin durch seine geringe Größe die Sensitivität eines Assays erhöhen (da ein Avidin-Molekül drei markierte Biotin-Moleküle binden kann).

Biotin-markierte Antikörper kommen in Techniken wie ELISA, Western Blot, Immunhistochemie, FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) etc. zum Einsatz.
Es gibt verschiedene Methoden zur Herstellung biotinylierter Antikörper, jedoch ist die Biotinylierung an primären Aminen nach wie vor das gängigste Verfahren. Dabei werden die ε-Aminogruppen der verfügbaren Lysinreste im Antikörper mit einem N-Hydroxysuccinimidester (NHS) eines Biotin-Analogons markiert.

Meerrettich-Peroxidase (Horseradish Peroxidase, HRP)

HRP ist ein typisches Reporterenzym für die Antikörper-Markierung und wird bei Techniken wie Western Blot, ELISA oder IHC (Immunhistochemie) eingesetzt. Das Enzym zeichnet sich durch eine sehr hohe Umsatzrate aus, die eine starke Signalentwicklung in kurzer Zeit ermöglicht.

Drei gängige Nachweismethoden arbeiten mit HRP-markierten Antikörpern:

  • Kolorimetrischer Nachweis: In Anwesenheit von Wasserstoffperoxid katalysiert HRP die Reduktion von H2O2 zu Wasser unter Oxidation eines Substrats wie 4-Chlor-1-Naphthol (4-CN), 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) oder Polymerisation von 3′-Diaminobenzidin (DAB). So entstehen gut sichtbare Farbreaktionen.
  • Chemilumineszenter Nachweis: Ebenfalls in Anwesenheit von Wasserstoffperoxid oxidiert HRP Luminol zu einem angeregten Zwischenprodukt, das zu 3′-Aminophthalat zerfällt und Licht mit 425 nm emittiert.
  • Auch ein fluoreszenter Nachweis ist – je nach eingesetztem Substrat – möglich.

Wie Biotin kann auch HRP an ε-Aminogruppen von Lysinresten gebunden werden. Alternativ kann HRP auch über Cysteinreste gekoppelt werden – dies erfolgt in zwei Schritten: zuerst werden die Disulfidbrücken des Antikörpers reduziert, anschließend wird ein thiolreaktives Reagenz (z. B. ein markiertes Maleimid) addiert.

Fluoresceinisothiocyanat (FITC)

FITC ist ein Isothiocyanat-Derivat von Fluorescein und verbindet sich mit primären Aminen und – nach Reduktion – auch mit Thiolgruppen von Lysin- und Cysteinresten biochemischer Moleküle. Typischerweise werden 3 bis 6 Fluorescein-Moleküle pro Antikörper gekoppelt, um Quenching und Löslichkeitsprobleme zu vermeiden.
Fluoreszierende Farbstoffe wie Fluorescein werden vielfach bei Western Blots, Durchflusszytometrie (FACS) und Immunfluoreszenz eingesetzt.

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